Публикации - Институт биологических исследований Солка

все публикации

2025

Кумар, А.Дж., Эплер, К., Ван, Дж., Шен, А., Самандари, Н., Рольфсен, М.Л., Барнс, Л.А., Шадель, Г.С., Мойзис, А.Г., Сайнс, А.Г., Улубабян, К., Ли, К., Джепсен, К., Ли, К., Фустер, М.М., Спрэгг, Р.Г., Сасик, Р., Валлон, В., Гудлак, Х., Икс, Дж.Х., Сингх, П., Хепокоски, М.Л. Митохондриальная ДНК почек способствует системному высвобождению ИЛ-6 при остром повреждении почек, связанном с сепсисом. (2025) Взгляд JCI. 10(23). DOI: 10.1172/jci.insight.177004

+ развернуть аннотацию

Дисфункция митохондрий является основным механизмом острого повреждения почек (ОПП), а повышенный уровень циркулирующего интерлейкина-6 (ИЛ-6) связан с системным воспалением и смертью от сепсиса. Мы проверили, способствует ли митохондриальная ДНК (мтДНК) почек высвобождению ИЛ-6 при ОПП, ассоциированном с сепсисом, через Toll-подобный рецептор 9 (TLR9). В мышиной модели сепсиса, вызванного перевязкой и перфорацией слепой кишки (CLP), мы использовали секвенирование мтДНК плазмы следующего поколения для разработки оптимальных целевых последовательностей для количественного определения методом капельной цифровой ПЦР и для идентификации однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) с целью определения тканевого происхождения. Мы обнаружили значительно более высокие концентрации мтДНК плазмы после CLP по сравнению с контрольной группой, и что SNP мтДНК плазмы больше соответствовали SNP почек, чем других органов. МтДНК почек напрямую влияла на высвобождение ИЛ-6 и мтДНК из дендритных клеток in vitro, а раствор митохондрий почек приводил к более высоким концентрациям ИЛ-6 in vivo. Высвобождение ИЛ-6 было снижено ингибитором TLR9. Наконец, концентрация мтДНК в плазме была значительно выше у пациентов с сепсисом и ОПН по сравнению с пациентами без ОПН и значительно коррелировала с концентрацией ИЛ-6 в плазме. Мы заключаем, что ОПН способствует повышению уровня циркулирующего ИЛ-6 при сепсисе посредством высвобождения мтДНК. Воздействие на митохондрии почек и высвобождение мтДНК являются потенциальными трансляционными направлениями для снижения смертности от ОПН, связанной с сепсисом.

Эспарса-Мольто, П.Б., Госвами, А.В., Бозкурт, С., Мюнх, К., Ньюман, Л.Е., Мойзис, А.Г., Рохас, Г.Р., Гуан, Д., Джонс, Дж.Р., Гейдж, Ф.Х., Шадель, Г.С. АФК-зависимая локализация гликолитических ферментов в митохондриях. (2025) Редокс Биол. 86:103812. DOI: 10.1016/j.redox.2025.103812

+ развернуть аннотацию

Митохондриальные активные формы кислорода (мтАФК) регулируют клеточные сигнальные пути, но также вызывают окислительный стресс при дерегуляции во время старения и патологических состояний, таких как нейродегенеративные заболевания. Динамическое перераспределение белков между клеточными компартментами является распространенным механизмом контроля их стабильности и биологической активности. Нацеливая биотинлигазу BirA∗ на внешнюю митохондриальную мембрану в клетках HEK293, мы идентифицировали белки, маркировка которых увеличивалась или уменьшалась в ответ на обработку менадионом, что согласуется с динамическим изменением их митохондриальной локализации в ответ на повышенную продукцию мтАФК. Эти белки представляют собой потенциальных кандидатов для будущих исследований митохондриальной сигнализации окислительного стресса. В этом скрининге была обнаружена подгруппа гликолитических ферментов, и подтверждено с помощью митохондриального фракционирования и визуализации, что увеличивает локализацию в митохондриях в ответ на менадион, несмотря на отсутствие изменений в их общем количестве. Исследования субмитохондриального фракционирования согласуются с импортом пула этих ферментов в межмембранное пространство митохондрий. Локализация гликолитических ферментов в митохондриях также была повышена в клетках, выращиваемых в условиях гипоксии или экспрессирующих оксидазу d-аминокислот, специфичную для митохондрий (условия, индуцирующие повышенную продукцию митохондриальных АФК), и базально ингибировалась в условиях нормального роста митохондриальным антиоксидантом MnTBAP. Наконец, в первичных фибробластах при болезни Альцгеймера также наблюдалось снижение активности гликолитических ферментов, ассоциированных с митохондриями, под действием антиоксидантов, что согласуется с повышением уровня митохондриальных АФК, изменяющим их относительное распределение между цитоплазмой и митохондриями. Мы предполагаем, что повышенная локализация митохондриальных гликолитических ферментов является адаптивным ответом на мтРОС, который изменяет поток глюкозы в сторону антиоксидантного пентозофосфатного пути, создает отдельные регуляторные пулы митохондриальных метаболитов или новые метаболические контуры и/или обеспечивает цитопротекцию или другие адаптивные реакции посредством дополнительных функций, не связанных с их ферментативной активностью.

Сайнс, А.Г., Рохас, Г.Р., Мойзис, А.Г., Доннелли, член парламента, Мангалхара, К.К., Джонсон, М.А., Эспарса-Мольто, П.Б., Грае, К.Дж., Шоу, Р.Дж., Шадель, Г.С. FAM43A координирует репликацию мтДНК и биогенез митохондрий в ответ на истощение мтДНК. (2025) Журнал клеточной биологии. 224(3). DOI: 10.1083/jcb.202311082

+ развернуть аннотацию

Пути митохондриальной ретроградной сигнализации (MRS) передают функциональный статус митохондрий для выявления гомеостатических или адаптивных изменений в экспрессии ядерных генов. Почкующиеся дрожжи имеют пути «межгеномной сигнализации», которые определяют количество митохондриальной ДНК (мтДНК) независимо от окислительного фосфорилирования (OXPHOS), основной функции генов, кодируемых мтДНК. Однако пути MRS, которые определяют количество мтДНК в клетках млекопитающих, остаются плохо изученными. Мы обнаружили, что клетки IMR90 с истощенной мтДНК могут поддерживать OXPHOS в течение значительного периода времени, что обеспечивает надежную модельную систему для исследования межгеномной сигнализации человека. Мы идентифицировали FAM43A, в значительной степени неохарактеризованный белок, как CHK2-зависимый ранний ответчик на истощение мтДНК. Истощение FAM43A активирует программу митохондриального биогенеза, что приводит к увеличению массы митохондрий и числа копий мтДНК посредством CHK2-опосредованной регуляции формы p53R2 рибонуклеотидредуктазы. Мы предполагаем, что FAM43A выполняет функцию контрольной точки, ограничивая митохондриальный биогенез и оборот в условиях истощения мтДНК или репликационного стресса.

Варанаси, С.К., Чен, Д., Лю, Ю., Джонсон, М.А., Миллер, СМ, Гангули, С., Ланде, К., ЛаПорта, М.А., Хоффманн, Ф.А., Манн, Т.Д., Тенече, М.Г., Касильяс, Э., Мангалхара К.С., Мэтью В., Сан М., Дженсен И.Дж., Фарсакоглу Ю., Чен Т., Паризи, Б., Деота, С., Хавас, А., Ли, Дж., Чунг, Х.К., Шитингер, А., Панда, С., Уильямс, А.Э., Фарбер, Д.Л., Дхар, Д., Адамс, П.Д. , Фэн, GS, Шадель, Г.С., Сундруд, М.С., Каеч, СМ. Синтез желчных кислот препятствует опухолеспецифическим Т-клеточным реакциям при раке печени. (2025) Наука. 387(6730):192-201. DOI: 10.1126/science.adl4100

+ развернуть аннотацию

Метаболический ландшафт рака в значительной степени влияет на противоопухолевый иммунитет, однако остается неясным, как органоспецифические метаболиты в микроокружении опухоли влияют на иммунологический надзор. Мы обнаружили, что накопление первичных конъюгированных и вторичных желчных кислот (BAs) является метаболической особенностью гепатоцеллюлярной карциномы человека и экспериментальных моделей рака печени. Ингибирование синтеза конъюгированных BA в гепатоцитах путем удаления BA-конъюгирующего фермента желчной кислоты-КоА:аминокислота-ацилтрансферазы (BAAT) усиливало опухолеспецифические реакции Т-клеток, уменьшало рост опухоли и повышало чувствительность опухолей к иммунотерапии антипрограммируемым белком клеточной смерти 1 (анти-PD-1). Кроме того, различные BAs по-разному регулировали Т-клетки CD8; первичные BAs вызывали окислительный стресс, тогда как вторичная BA литохолевая кислота ингибировала функцию Т-клеток через стресс эндоплазматического ретикулума, которому противодействовала урсодезоксихолевая кислота. Мы демонстрируем, что изменение синтеза БА или потребления урсодезоксихолевой кислоты с пищей может улучшить иммунотерапию опухолей в модельных системах рака печени.

2024

Скьявон, Ч.Р., Ван, Ю., Фенг, Дж.В., Гарретт, С., Сунг, Т.К., Дэйн, Ю., Ван, К., Юл, Р.Дж., Кинтеро-Кармона, О.А., Шадель, Г.С., Усадьба, У. INF2-опосредованная полимеризация актина при контактах ER с органеллами регулирует размер и движение органелл. (2024) Рес пл. DOI: 10.21203/rs.3.rs-4720604/v1

+ развернуть аннотацию

Панг, Х.Дж., Хеймлер, С.Р., Скандалис, Л.М., Уинг, Д., Моран, Р., Николс, Дж.Ф., Морено, Д., Шадель, Г.С., Гейдж, Ф.Х., Молина, AJA Протокол для клинической когорты Шокового центра Натана в Сан-Диего: новый ресурс для изучения старения человека. (2024) BMJ Open. 14(6):e082659. DOI: 10.1136/bmjopen-2023-082659

+ развернуть аннотацию

Максвелл, МБ, Хом-Тедла, М.С., Йи, Дж., Ли, С., Ривера, С.А., Ю, Дж., Бернс, М.Дж., Макрей, Х.М., Стивенсон, Б.Т., Коакли, К.Е., Хо, Дж., Гастелум, К.Б., Белл, Дж.С., Джонс, А.С., Эскандер, Р.Н., Дыхейзен, Э.К., Шадель, Г.С., Кеч, С.М., Харгривз, округ Колумбия ARID1A подавляет опосредованную R-петлей активацию пути интерферона I типа STING противоопухолевого иммунитета. (2024) Cell. DOI: 10.1016 / j.cell.2024.04.025

+ развернуть аннотацию

Клинические испытания выявили увеличение количества мутаций ARID1A среди пациентов, которые положительно реагируют на блокаду иммунных контрольных точек (ICB) при нескольких типах солидных опухолей, независимо от микросателлитной нестабильности. Мы показываем, что потеря ARID1A на мышиных моделях достаточна для индукции противоопухолевых иммунных фенотипов, наблюдаемых при мутантном раке человека по ARID1A, включая повышенную инфильтрацию CD8+ Т-клеток и цитолитическую активность. Рак с дефицитом ARID1A активировал сигнатуру экспрессии гена интерферона (IFN), сигнатуру ARID1A-IFN, связанную с увеличением R-петлей и цитозольной одноцепочечной ДНК (оцДНК). Сверхэкспрессия фермента, разрешающего R-петлю, RNASEH2B, или цитозольной ДНКазы TREX1, в клетках с дефицитом ARID1A предотвращала накопление цитозольной оцДНК и активацию гена ARID1A-IFN. Кроме того, сигнатура ARID1A-IFN и противоопухолевый иммунитет были обусловлены STING-зависимой передачей сигналов IFN типа I, которая была необходима для улучшения реакции мутантных опухолей ARID1A на лечение ICB. Эти результаты определяют молекулярный механизм, лежащий в основе противоопухолевого иммунитета при мутантном раке ARID1A.

Ньюман, Л.Е., Вайзер Новак, С., Рохас, Г.Р., Тадепалле, Н., Скьявон, Ч.Р., Гротьян, Д.А., Тауэрс, К.Г., Трамбле, М., Доннелли, М.П., Гош, С., Медина, М., Роча С., Родригес-Энрикес Р., Чевес Х.А., Лемерсал И., Мэнор У., Шадель, Г.С. Стресс репликации митохондриальной ДНК запускает провоспалительный эндосомальный путь утилизации нуклеоидов. (2024) Природа клеточной биологии. DOI: 10.1038/s41556-023-01343-1

+ развернуть аннотацию

Митохондриальная ДНК (мтДНК) кодирует важные субъединицы системы окислительного фосфорилирования, но также представляет собой молекулярный паттерн, связанный с основным повреждением (DAMP), который задействует сенсоры врожденного иммунитета при высвобождении в цитоплазму, за пределы клеток или в кровообращение. Будучи DAMP, мтДНК не только способствует устойчивости к антивирусным препаратам, но также вызывает патогенное воспаление при многих заболеваниях. Клетки, испытывающие стресс мтДНК, вызванный истощением белка, упаковывающего мтДНК, фактора транскрипции А, митохондрий (TFAM) или во время инфекции вирусом простого герпеса-1, демонстрируют удлинение митохондрий, увеличение нуклеоидов (комплексы мтДНК-белок) и активацию врожденного cGAS-STING. передача иммунных сигналов через мтДНК, высвобождаемую в цитоплазму. Однако связь между аберрантными митохондриями и динамикой нуклеоидов, высвобождением мтДНК и активацией cGAS-STING остается неясной. Здесь мы показываем, что при различных стрессовых условиях репликации мтДНК и во время инфекции вирусом простого герпеса-1 увеличенные нуклеоиды, которые остаются связанными с TFAM, выходят из митохондрий. Увеличенные нуклеоиды возникают в результате того, что мтДНК испытывает стресс репликации, что вызывает кластеризацию нуклеоидов посредством блокады деления митохондрий на стадии, когда обычно начинается полимеризация актина эндоплазматической сети, определяя контрольную точку деления, которая гарантирует, что мтДНК завершила репликацию и способна к разделению на дочерние митохондрии. Хроническое задействование этой контрольной точки приводит к попаданию увеличенных нуклеоидов в ранние, а затем и в поздние эндосомы для утилизации. Разрыв эндосом во время прохождения по этому эндосомальному пути в конечном итоге вызывает опосредованную мтДНК активацию cGAS-STING. Таким образом, мы предполагаем, что некомпетентные к репликации нуклеоиды избирательно элиминируются с помощью адаптивного митохондриально-эндосомного пути контроля качества, который склонен к активации врожденной иммунной системы, что может представлять собой терапевтическую мишень для предотвращения воспаления, опосредованного мтДНК, во время вирусной инфекции и других патогенных состояний.

2023

Викторелли, С., Салмонович, Х., Чепмен, Дж., Мартини, Х., Визиоли, М.Г., Райли, Дж.С., Клуа, К., Холл-Янгер, Э., Мачадо Эспиндола-Нетто, Дж., Джурк, Д., Лагнадо, А.Б., Сейлс Гомес, Л., Фарр, Дж.Н., Сол, Д., Рид, Р., Келли, Г., Эппард, М., Гривз, Л.К., Доу, З., Пириус, Н. , Щепановска, К., Порритт, Р.А., Хуанг, Х., Хуанг, Т.Ю., Манн, Д.А., Масуда, К.А., Хосла, С., Дай, Х., Кауфманн, С.Х., Захариудакис, Э., Гаватиотис, Э. , ЛеБрассер, Н.К., Лей, Х., Сайнс, А.Г., Корольчук, В.И., Адамс, П.Д., Шадель, Г.С., Тейт, SWG, Пассос, JF Апоптозный стресс вызывает высвобождение мтДНК во время старения и запускает SASP. (2023) Природа. DOI: 10.1038/s41586-023-06621-4

+ развернуть аннотацию

Стареющие клетки вызывают возрастную дисфункцию тканей частично за счет индукции секреторного фенотипа, связанного с хроническим старением (SASP). Митохондрии являются основными регуляторами SASP; однако основные механизмы не выяснены. Митохондрии часто необходимы для апоптоза, судьбы клеток, отличной от клеточного старения. Во время апоптоза широко распространенная проницаемость наружной мембраны митохондрий (MOMP) приводит к гибели клетки. Здесь мы обнаружили, что MOMP, возникающий в подмножестве митохондрий, является признаком клеточного старения. Этот процесс, называемый миноритарным MOMP (miMOMP), требует макропор BAX и BAK, обеспечивающих высвобождение митохондриальной ДНК (мтДНК) в цитозоль. Цитозольная мтДНК, в свою очередь, активирует путь cGAS-STING, основной регулятор SASP. Мы обнаружили, что ингибирование MOMP in vivo снижает маркеры воспаления и улучшает продолжительность жизни пожилых мышей. Наши результаты показывают, что апоптоз и старение регулируются сходными митохондриально-зависимыми механизмами и что сублетальный митохондриальный апоптозный стресс является основным фактором развития SASP. Мы предоставляем подтверждение концепции того, что ингибирование воспаления, вызванного miMOMP, может быть терапевтическим путем для улучшения продолжительности жизни.

Мангалхара, К.К., Варанаси, С.К., Джонсон, М.А., Бернс, М.Дж., Рохас, Г.Р., Эспарса Молто, П.Б., Сайнс, А.Г., Тадепалле, Н., Эбботт, К.Л., Мендиратта, Г., Чен, Д., Фарсакоглу, Ю., Кунчок Т., Хоффманн Ф.А., Паризи Б., Ринкон М., Вандер Хайден М.Г., Бозенберг М., Харгривз Д.К., Кеч С.М., Шадель, Г.С. Манипулирование потоком митохондриальных электронов повышает иммуногенность опухоли. (2023) Наука. 381(6664):1316-1323. DOI: 10.1126/science.abq1053.

+ развернуть аннотацию

Хотя для роста опухоли требуется митохондриальная цепь транспорта электронов (ETC), относительный вклад комплекса I (CI) и комплекса II (CII), привратников для инициации потока электронов, остается неясным. В этой работе мы сообщаем, что потеря CII, но не CI, снижает рост опухоли меланомы за счет увеличения презентации антигена и опосредованного Т-клетками уничтожения. Это обусловлено опосредованной сукцинатом транскрипционной и эпигенетической активацией генов главного комплекса гистосовместимости, обработки и презентации антигена (MHC-APP), независимо от передачи сигналов интерферона. Кроме того, нокаут J-белка, контролируемого метилированием (MCJ), для содействия входу электронов преимущественно через CI, обеспечивает доказательство концепции перестройки ETC для достижения противоопухолевых ответов без побочных эффектов, связанных с общим снижением митохондриального дыхания в нераковых клетках. Наши результаты могут иметь терапевтический потенциал для опухолей, у которых снижена экспрессия MHC-APP — распространенный механизм уклонения от иммунитета рака.

Лей, Ю., ВанПортфлит, Дж.Дж., Чен, И.Ф., Брайант, Д.Д., Ли, Ю., Фейлс, Д., Торрес-Одио, С., Раган, К.Б., Денг, Дж., Мохан, А., Ван, Б., Брамс, О.Н., Йейтс, С.Д., Спенсер, М., Тонг, К.В., Бозенберг, М.В., Уэст, Л.С., Шадель, Г.С., Шатт, Т.Е., Аптон, Дж.В., Ли, П., Уэст, А.П. Совместное восприятие митохондриальной ДНК с помощью ZBP1 и cGAS способствует кардиотоксичности. (2023) Cell. DOI: 10.1016 / j.cell.2023.05.039

+ развернуть аннотацию

Митохондриальная ДНК (мтДНК) является мощным агонистом врожденной иммунной системы; однако точные иммуностимулирующие свойства мтДНК и кинетика обнаружения цитозольными сенсорами нуклеиновых кислот остаются плохо изученными. Здесь мы показываем, что нестабильность митохондриального генома способствует накоплению Z-формы ДНК. Белок 1, связывающий Z-ДНК (ZBP1), стабилизирует Z-форму мтДНК и образует цитозольный комплекс, содержащий cGAS, RIPK1 и RIPK3, для поддержания фосфорилирования STAT1 и передачи сигналов интерферона I типа (IFN-I). Повышенная Z-форма мтДНК, экспрессия ZBP1 и передача сигналов IFN-I наблюдаются в кардиомиоцитах после воздействия доксорубицина, химиотерапевтического агента первой линии, который часто вызывает кардиотоксичность у онкологических больных. Поразительно, но мыши, у которых отсутствует передача сигналов ZBP1 или IFN-I, защищены от кардиотоксичности, вызванной доксорубицином. Наши результаты показывают, что ZBP1 является кооперативным партнером для cGAS, который поддерживает ответы IFN-I на нестабильность митохондриального генома, и подчеркивают ZBP1 как потенциальную мишень при сердечной недостаточности и других расстройствах, при которых стресс мтДНК способствует патологии, связанной с интерфероном.

Аль Хатиб, И., Денг, Дж., Лей, Ю., Торрес-Одио, С., Рохас, Г.Р., Ньюман, Л.Е., Чанг, Б.К., Саймс, А., Чжан, Х., Хуанг, С.Н., Поммье Ю., Хан А., Шадель, Г.С., Уэст, AP, Гибсон, WT, Шатт, TE Активация врожденного иммунного ответа cGAS-STING в клетках с дефицитом митохондриальной топоизомеразы TOP1MT. (2023) Молекулярная генетика человека. DOI: 10.1093/hmg/ddad062

+ развернуть аннотацию

Признание того, что цитозольная мтДНК активирует передачу сигналов врожденного иммунитета cGAS-STING, открыло новые механизмы заболевания. Здесь нехарактерный вариант, который, по прогнозам, влияет на функцию TOP1MT, P193L, был обнаружен в семье с множественными аутоиммунными заболеваниями с ранним началом, включая системную красную волчанку (СКВ). Хотя ранее не было генетической связи между TOP1MT и аутоиммунным заболеванием, роль TOP1MT в качестве регулятора мтДНК привела нас к изучению того, может ли TOP1MT опосредовать высвобождение мтДНК в цитозоль, где он затем может активировать врожденный иммунный путь cGAS-STING. Известно, что он активируется при СКВ и других аутоиммунных заболеваниях. Анализируя клетки со сниженной экспрессией TOP1MT, мы показываем, что потеря TOP1MT приводит к высвобождению мтДНК в цитозоль, что активирует путь cGAS-STING. Мы также охарактеризовали вариант P193L по его способности восстанавливать несколько функций TOP1MT при экспрессии в нокаутных клетках TOP1MT. Мы показываем, что вариант P193L не является полностью функциональным, так как его реэкспрессия на высоких уровнях была неспособна восстановить дефицит митохондриального дыхания и показала лишь частичное восстановление других функций, включая восполнение репликации мтДНК после истощения, размер нуклеоида, стационарное состояние мтДНК. уровней транскриптов и митохондриальной морфологии. Кроме того, экспрессия P193L на эндогенных уровнях не могла восстановить опосредованную высвобождением мтДНК передачу сигналов cGAS-STING. В целом, мы сообщаем о связи между TOP1MT и высвобождением мтДНК, ведущей к активации cGAS-STING. Более того, мы показываем, что вариант P193L имеет частичную потерю функции, которая может способствовать восприимчивости к аутоиммунным заболеваниям через опосредованную cGAS-STING активацию врожденной иммунной системы.

Малик, Н., Феррейра, Б.И., Холлштейн, П.Е., Кертис, С.Д., Трефтс, Э., Вайзер Новак, С., Ю, Дж., Гилсон, Р., Хеллберг, К., Фанг, Л., Шеридан, А., Ха, Н., Шадель, Г.С., Усадьба, У., Шоу, Р.Дж. Индукция лизосомального и митохондриального биогенеза путем фосфорилирования AMPK FNIP1. (2023) Наука. 380(6642):eabj5559. DOI: 10.1126/science.abj5559

+ развернуть аннотацию

Клетки реагируют на митохондриальные яды быстрой активацией аденозинмонофосфат-активируемой протеинкиназы (AMPK), вызывая острые метаболические изменения посредством фосфорилирования и пролонгированной адаптации метаболизма посредством эффектов транскрипции. Фактор транскрипции EB (TFEB) является основным эффектором AMPK, который увеличивает экспрессию лизосомных генов в ответ на энергетический стресс, но то, как AMPK активирует TFEB, остается нерешенным. Мы демонстрируем, что AMPK напрямую фосфорилирует пять консервативных остатков серина в фолликулин-взаимодействующем белке 1 (FNIP1), подавляя функцию комплекса фолликулин (FLCN)-FNIP1. Фосфорилирование FNIP1 необходимо для того, чтобы AMPK индуцировала ядерную транслокацию TFEB и TFEB-зависимое увеличение коактиватора гамма-рецептора, активируемого пролифератором пероксисом, 1-альфа (PGC1α) и матричной РНК альфа-рецептора, связанного с эстрогеном (ERRα). Т.о., повреждение митохондрий запускает AMPK-FNIP1-зависимую ядерную транслокацию TFEB, индуцируя последовательные волны лизосомального и митохондриального биогенеза.

Ньюман, LE, Шадель, Г.С. Высвобождение митохондриальной ДНК при передаче сигналов врожденного иммунитета. (2023) Ежегодный обзор биохимии. DOI: 10.1146/annurev-biochem-032620-104401

+ развернуть аннотацию

Согласно эндосимбиотической теории, большая часть ДНК исходного бактериального эндосимбионта была утрачена или перенесена в ядро, оставив гораздо меньшую (∼16 т.п.н. у млекопитающих) кольцевую молекулу, которая представляет собой современную митохондриальную ДНК (мтДНК). Способность мтДНК покидать митохондрии и интегрироваться в ядерный геном была обнаружена у почкующихся дрожжей, наряду с генами, регулирующими этот процесс. Митохондрии стали ключевыми регуляторами врожденного иммунитета, и в настоящее время признано, что мтДНК, высвобождаемая в цитоплазму, вне клетки или в кровоток, активирует множественные сигнальные пути врожденного иммунитета. Здесь мы сначала рассмотрим механизмы, посредством которых мтДНК высвобождается в цитоплазму, включая несколько индуцируемых митохондриальных пор и дефектную митофагию или аутофагию. Далее мы рассмотрим, как различные формы высвобождаемой мтДНК активируют специфические сенсоры нуклеиновых кислот врожденного иммунитета и инфламмасомы. Наконец, мы обсуждаем, как высвобождение внутриклеточной и внеклеточной мтДНК, включая циркулирующую внеклеточную мтДНК, которая способствует системному воспалению, влияет на заболевания человека, бактериальные и вирусные инфекции, старение и старение. Ожидаемая дата окончательной онлайн-публикации 92-го тома — июнь 2023 года. Пересмотренные оценки см. на http://www.annualreviews.org/page/journal/pubdates.

Нассур Дж., Агиар Л.Г., Коррейя А., Шмидт Т., Майнц Л., Пшетоцкая С., Хаггблом С., Тадепалле Н., Вильямс А., Шохирев М.Н., Акинджилар, СК, Тергаонкар В., Шадель, С., Карлседер, Дж. Передача сигналов теломер в митохондрии с помощью ZBP1 опосредует репликативный кризис (2023) Природа. DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-05710-8

+ развернуть аннотацию

Рак возникает из-за накопления генетических и эпигенетических изменений, которые позволяют клеткам обходить теломерные пролиферативные барьеры и достигать бессмертия. Одним из таких барьеров является репликативный кризис — зависимая от аутофагии программа, которая устраняет клетки с дефицитом контрольных точек с нестабильными теломерами и другими связанными с раком хромосомными аберрациями1,2. Однако мало что известно о молекулярных событиях, которые регулируют возникновение этого важного противоопухолевого барьера. Здесь мы идентифицировали врожденный иммунный сенсор Z-ДНК-связывающий белок 1 (ZBP1) как регулятор кризисной программы. Изоформа ZBP1, связанная с кризисом, индуцируется cGAS-STING ДНК-сенсорным путем, но достигает полной активации только при ассоциации с транскриптами РНК, содержащими теломерные повторы (TERRA), которые синтезируются из дисфункциональных теломер. Связанный с TERRA ZBP1 олигомеризуется в филаменты на внешней митохондриальной мембране подмножества митохондрий, где он активирует митохондриальный противовирусный сигнальный белок врожденного иммунного адаптера (MAVS). Мы предполагаем, что эти свойства олигомеризации ZBP1 служат механизмом усиления сигнала, где нескольких взаимодействий TERRA-ZBP1 достаточно для запуска вредного MAVS-зависимого интерферонового ответа. Наше исследование раскрывает механизм опосредованного теломерами подавления опухоли, при котором дисфункциональные теломеры активируют врожденные иммунные ответы через митохондриальные комплексы TERRA-ZBP1 для элиминации клеток, предназначенных для неопластической трансформации.

2022

Кобо, И., Танака, Т.Н., Чандра Мангалхара, К., Лана, А., Йенг, К., Хан, К., Шлахецки, Дж., Чалкомб, Дж., Фикссен, Б.Р., Сакаи, М., Ли , Р.З., Филдс, Х., Мокры, М., Цай, Р.Г., Бежар, Р., Прандж, К., де Винтер, М., Шадель, Г.С., Стекло, ЧК ДНК-метилтрансфераза 3 альфа и ТЕТ-метилцитозиндиоксигеназа 2 сдерживают митохондриальную ДНК-опосредованную передачу сигналов интерферона в макрофагах. (2022) Иммунитет. DOI: 10.1016/j.immuni.2022.06.022.

+ развернуть аннотацию

Хэнкок-Черутти, В., Ву, З., Сюй, П., Ядавалли, Н., Леонзино, М., Таркешвар, А.К., Фергюсон, С.М., Шадель, Г.С., Де Камилли, П. Белок переноса липидов ER-лизосом VPS13C / PARK23 предотвращает аберрантную мтДНК-зависимую передачу сигналов STING (2022) Журнал клеточной биологии. 221(7):e202106046. DOI: DOI: 10.1083/jcb.202106046

+ развернуть аннотацию

Сиань Х., Ватари К., Санчес-Лопес Э., Оффенбергер Дж., Онюру Дж., Сампат Х., Ин В., Хоффман Х.М., Шадель, Г.С., Карин, М. Окисленные фрагменты ДНК выходят из митохондрий через mPTP- и VDAC-зависимые каналы, чтобы активировать инфламмасому NLRP3 и передачу сигналов интерферона. (2022) Иммунитет. DOI: 10.1016/j.immuni.2022.06.007.

+ развернуть аннотацию

Митохондриальная ДНК (мтДНК), ускользающая из стрессовых митохондрий, провоцирует воспаление посредством активации пути cGAS-STING, а при окислении (Ox-мтДНК) связывает цитозольный NLRP3, тем самым вызывая активацию воспаления. Однако неизвестно, как и в какой форме Ox-mtDNA выходит из стрессовых митохондрий в неапоптотических макрофагах. Мы обнаружили, что различные активаторы воспаления NLRP3 быстро стимулировали опосредованное uniporter поглощение кальция, открывая митохондриальные переходные поры проницаемости (mPTP) и запуская олигомеризацию VDAC. Это произошло независимо от мтДНК или активных форм кислорода, которые индуцируют генерацию Ox-мтДНК. Внутри митохондрий Ox-mtDNA либо восстанавливалась ДНК-гликозилазой OGG1, либо расщеплялась эндонуклеазой FEN1 на фрагменты размером 500-650 п.н., которые выходили из митохондрий через mPTP- и VDAC-зависимые каналы, чтобы инициировать активацию цитозольной NLRP3 инфламмасомы. Фрагменты Ox-mtDNA также активировали передачу сигналов cGAS-STING и давали начало провоспалительной внеклеточной ДНК. Понимание этого процесса будет способствовать разработке потенциальных методов лечения хронических воспалительных заболеваний, примером которых являются ингибиторы FEN1, которые подавляют выработку интерлейкина-1β (IL-1β) и высвобождение мтДНК у мышей.

Хепокоски М.Л., Одиш М.Ф., Лам М.Т., Куфаль Н.Г., Рольфсен М.Л., Шадель, Г.С., Мойзис А.Г., Сайнс А.Г., Такиар П.Г., Патель С., Леонард А.Дж., Самандари Н., Хансен Э., Трескотт С., Нгуен К., Джепсен К., Каттер Г. ., Гиллеспи, М.Н., Спрэгг, Р.Г., Сасик, Р., Икс, Дж.Х. Абсолютная количественная оценка митохондриальной ДНК плазмы с помощью капельной цифровой ПЦР позволяет оценить тяжесть COVID-19 с течением времени во время госпитализации в отделение интенсивной терапии. (2022) Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. DOI: 10.1152/ajplung.00128.2022.

+ развернуть аннотацию

Повышенные концентрации митохондриальной ДНК в плазме связаны с неблагоприятными исходами многих критических заболеваний, включая COVID-19. Однако современные методы количественного определения бесклеточной митохондриальной ДНК в плазме требуют много времени и не воспроизводимы. Здесь мы использовали секвенирование следующего поколения, чтобы охарактеризовать размер и расположение генома циркулирующей митохондриальной ДНК у пациентов в критическом состоянии с COVID-19, чтобы разработать простой и оптимальный метод количественной оценки с помощью капельной цифровой ПЦР. Секвенирование выявило большой процент небольших фрагментов митохондриальной ДНК в плазме с широкой вариабельностью охвата в зависимости от местоположения генома. Мы идентифицировали зонды для генов митохондриальной ДНК, цитохрома B и NADH-дегидрогеназы 1, в областях с относительно высоким охватом, которые нацелены на небольшие последовательности, потенциально пропущенные другими методами. Затем были проведены серийные оценки абсолютных концентраций митохондриальной ДНК в плазме 20 пациентов с COVID-19 в критическом состоянии без этапа выделения ДНК. Концентрация митохондриальной ДНК в день регистрации была значительно повышена у пациентов с умеренным или тяжелым острым респираторным дистресс-синдромом (ОРДС) по сравнению с пациентами без ОРДС или с легким ОРДС. Сравнение концентраций митохондриальной ДНК с течением времени между выжившими пациентами с ОРДС без/легкой степени, выжившими пациентами с ОРДС средней/тяжелой степени и невыжившими показало самые высокие концентрации у пациентов с более тяжелым заболеванием. Абсолютная количественная оценка митохондриальной ДНК с помощью капельной цифровой ПЦР является быстрой и воспроизводимой; таким образом, мы предоставляем ценный инструмент и обоснование для будущих исследований по оценке митохондриальной ДНК в качестве биомаркера в реальном времени для принятия клинических решений у пациентов с COVID-19 в критическом состоянии.

2021

Шадель, Г.С., Адамс, П.Д., Берггрен, В.Т., Дидрих, Дж.К., Диффендерфер, К.Е., Гейдж, Ф.Х., Ха, Н., Хансен, М., Хетцер, М.В., Молина, А.Дж.А., Манор, У., Марек, К., О. Киф Д.Д., Пинто А.Ф.М., Сакко А., Шарпи Т.О., Шокриев М.Н., Замбетти С. Шоковый центр Натана в Сан-Диего: борьба с неоднородностью старения. (2021) Геронаука. DOI: 10.1007 / s11357-021-00426-x

+ развернуть аннотацию

Понимание основных механизмов старения открывает большие перспективы для разработки вмешательств, которые одновременно предотвращают или отсрочивают многие возрастные ухудшения и заболевания и увеличивают продолжительность жизни человека. Однако основным мешающим фактором в исследованиях старения является неоднородность самого процесса старения. На уровне организма ясно, что хронологический возраст не всегда предсказывает биологический возраст или предрасположенность к слабости или патологии. В то время как генетика и окружающая среда являются основными факторами, определяющими переменные скорости старения, возникает дополнительная сложность, поскольку различные органы, ткани и типы клеток по своей природе гетерогенны и демонстрируют разные траектории старения в норме или в ответ на стрессы процесса старения (например, накопление повреждений). . Борьба с неоднородностью старения требует новых и специализированных инструментов (например, анализа отдельных клеток, подходов на основе масс-спектрометрии и расширенной визуализации) для выявления новых признаков старения в разных масштабах. Затем потребуются передовые вычислительные подходы для интеграции этих разрозненных наборов данных и выяснения сетевых взаимодействий между известными признаками старения. Также существует потребность в усовершенствованных моделях старения на основе клеток человека, чтобы гарантировать, что результаты основных исследований актуальны для вмешательств, направленных на старение человека и сохранение здоровья. Шоковый центр Натана в Сан-Диего (SD-NSC) предоставляет доступ к передовым научным ресурсам для облегчения изучения неоднородности старения в целом и для продвижения использования новых моделей старения клеток человека. Центр также имеет надежное ядро развития исследований, которое финансирует пилотные проекты по неоднородности старения и организует инновационные учебные мероприятия, включая семинары и персонализированную программу наставничества, чтобы помочь исследователям, плохо знакомым со старением, добиться успеха. Наконец, SD-NSC участвует в информационно-просветительской деятельности, чтобы информировать общественность о важности исследований старения и, в частности, продвигать необходимость фундаментальных исследований биологии старения.

Ву, З., Сайнс, А.Г., Шадель, Г.С. Митохондриальная ДНК: клеточный сигнализатор генотоксического стресса. (2021) Тенденции биохимических наук. DOI: 10.1016/j.tibs.2021.05.004

+ развернуть аннотацию

Тадепалле, Н., Шадель, Г.С. РНК сообщает последние новости из митохондрий. (2021) Молекулярная клетка. 81(9):1863-1865. DOI: 10.1016/j.molcel.2021.04.005

+ развернуть аннотацию

Лей, Ю., Чжан, Дж., Скьявон, Ч.Р., Хе, М., Чен, Л., Шен, Х., Чжан, Ю., Инь, К., Чо, Ю., Андраде, Л., Шадель, Г.С., Hepokoski, M., Lei, T., Wang, H., Zhang, J., Yuan, JX, Malhotra, A., Manor, U., Wang, S., Yuan, ZY, Shyy, JY Спайковый белок SARS-CoV-2 нарушает функцию эндотелия за счет подавления ACE2. (2021) Исследование тиража. DOI: 10.1161/CIRCRESAHA.121.318902

Шварц Р.Е., Шохирев М.Н., Андраде Л.Р., Гуткинд Д.С., Иглесиас-Бартоломе Р., Шадель, Г.С. Взгляд на старение эпителиальных клеток на основе анализа транскриптома и секретома кератиноцитов полости рта человека. (2021) Старение. 13. DOI: 10.18632/aging.202658

+ развернуть аннотацию

Стареющие клетки вызывают хроническое воспаление, которое способствует заболеваниям и слабостям старения. Как этот процесс организован в эпителиальных клетках, являющихся источником карциномы человека, плохо изучено. Мы использовали нормальные оральные кератиноциты человека (NOK) для выяснения программ старения в прототипе первичной эпителиальной клетки слизистой оболочки, которая стареет спонтанно. Хотя NOK проявляют несколько типичных аспектов старения, они также демонстрируют различные характеристики. К ним относится экспрессия p21WAF1/CIP1 на ранних пассажах, что делает этот общий маркер старения ненадежным в NOK. Анализ транскриптома с помощью RNA-seq выявил специфические сходства с раковыми клетками и отличия от них, объясняя роль старения в избегании опухоли. У двух доноров наблюдалась репрессия генов репарации ДНК, которая коррелировала с подавлением мРНК и белка E2F1; расходящийся результат был замечен для третьего. Используя протеомное профилирование секреции, связанной с растворимыми (невезикулярными) и внеклеточными везикулами (EV), мы предлагаем дополнения к секреторному фенотипу, связанному со старением, включая HSP60, который локализуется на поверхности EV. Наконец, EV из стареющих NOK активируют передачу сигналов интерферонового пути в моноцитах THP-1 STING-зависимым образом и связываются с митохондриальной и ядерной ДНК. Наши результаты подчеркивают изменения старения в эпителиальных клетках и то, как они могут способствовать хроническому воспалению и возрастным заболеваниям.

Шиавон, ЧР, Шадель, Г.С., Усадьба, У. Нарушение подвижности митохондрий при болезни Шарко-Мари-Тута. (2021) Front Cell Dev Biol. 9:624823. DOI: 10.3389/fcell.2021.624823

+ развернуть аннотацию

2020

Шиавон, Ч.Р., Чжан, Т., Чжао, Б., Мур, А.С., Уэльс, П., Андраде, Л.Р., Ву, М., Сун, Т.С., Дайн, Ю., Фенг, Дж.В., Кинтеро, О.А., Шадель, Г.С., Гросс Р., Манор У. Визуализация актиновых хромотел выявляет суборганеллярную динамику актина. (2020) Природные методы. DOI: 10.1038/s41592-020-0926-5

+ развернуть аннотацию

2019

Ву, З., Ок, С., Уэст, А.П., Мангалхара, К.С., Сайнс, А.Г., Ньюман, Л.Е., Чжан, Х.О., Ву, Л., Ян, К., Бозенберг, М., Лю, Ю., Сулковски П.Л., Триппл В., Каеч С.М., Глейзер П.М., Шадель, Г.С. Сигнализация стресса митохондриальной ДНК защищает ядерный геном. [Опубликовано] (2019) Природа Метаболизм. 1(12):1209-1218. DOI: 10.1038/s42255-019-0150-8

+ развернуть аннотацию

Геном млекопитающих включает ядерную ДНК (яДНК), полученную от обоих родителей, и митохондриальную ДНК (мтДНК), которая наследуется по материнской линии и кодирует основные белки, необходимые для окислительного фосфорилирования. Тысячи копий кольцевой мтДНК присутствуют в большинстве типов клеток, которые упакованы TFAM в структуры более высокого порядка, называемые нуклеоидами1. Митохондрии также являются платформами для передачи противовирусных сигналов2, и, благодаря их бактериальному происхождению, мтДНК и другие митохондриальные компоненты запускают врожденные иммунные ответы и воспалительную патологию. Ранее мы показали, что нестабильность и цитоплазматическое высвобождение мтДНК активирует путь cGAS-STING-TBK1, что приводит к экспрессии интерферон-стимулированного гена (ISG), который способствует противовирусному иммунитету4. Здесь мы обнаруживаем, что постоянный стресс мтДНК не связан с базально активированной передачей сигналов NF-κB или экспрессией гена интерферона, типичной для острого противовирусного ответа. Вместо этого специфическое подмножество ISGs, которое включает , остается активированным нефосфорилированной формой ISGF3 (U-ISGF3), которая усиливает повреждения яДНК и ответы на восстановление. В культивируемых первичных фибробластах и раковых клетках химиотерапевтический препарат доксорубицин вызывает повреждение и высвобождение мтДНК, что приводит к cGAS-STING-зависимой активации ISG. Кроме того, стресс мтДНК в клетках меланомы мышей с дефицитом TFAM приводит к образованию опухолей, более устойчивых к доксорубицину. Наконец, у мышей, подвергшихся воздействию ионизирующего излучения, наблюдается усиленная реакция восстановления яДНК в селезенке. Следовательно, мы предполагаем, что повреждение и последующее высвобождение мтДНК вызывает защитный сигнальный ответ, который усиливает репарацию нДНК в клетках и тканях, предполагая, что мтДНК является сигнальным сигналом генотоксического стресса.

Гейл, М., Ли, Ю., Цао, Дж., Лю, З.З., Холмбек, М.А., Чжан, М., Ланг, С.М., Ву, Л., До Карму, М., Гупта, С., Аошима, К., ДиДжованна М.П., Штерн Д.Ф., Римм Д.Л., Шадель, Г.С., Чен С., Ян К. Приобретенная устойчивость к терапии, направленной на HER2, создает уязвимость к ингибированию АТФ-синтазы. (2019) Исследования рака. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-18-3985

+ развернуть аннотацию

Приобретенная резистентность к терапии, направленной на HER2, часто возникает при HER2+ опухолях молочной железы, и необходимы новые стратегии преодоления резистентности. Здесь мы сообщаем, что устойчивость к трастузумабу обратима, поскольку устойчивые клетки восстанавливали чувствительность к лекарству после культивирования в среде без лекарств. Анализ секвенирования РНК показал, что клетки, устойчивые к трастузумабу или комбинации трастузумаб + пертузумаб, увеличивали экспрессию генов пути окислительного фосфорилирования. Несмотря на минимальные изменения в митохондриальном дыхании, эти клетки проявляли повышенную экспрессию генов АТФ-синтазы и избирательную зависимость от функции АТФ-синтазы. Резистентные клетки были чувствительны к ингибированию АТФ-синтазы олигомицином А, а нокдаун АТФ5J или АТФ5В, компонентов комплекса АТФ-синтазы, делал резистентные клетки чувствительными к низкой дозе трастузумаба. Кроме того, сочетание ингибитора АТФ-синтазы олигомицина А с трастузумабом приводило к регрессии резистентных к трастузумабу опухолей in vivo. В заключение мы идентифицируем новую уязвимость клеток с приобретенной устойчивостью к терапии антителами, нацеленными на HER2, и раскрываем новую терапевтическую стратегию для преодоления устойчивости.

Харел М., Ортенберг Р., Варанаси С.К., Мангалхара К.Ц., Мардамшина М., Марковиц Э., Барух Э.Н., Триппл В., Арама-Чайот М., Гринберг Э., Шеной , А., Аясун, Р., Кнафо, Н., Сюй, С., Анафи, Л., Янович-Арад, Г., Варнава, Г.Д., Ашкенази, С., Бессер, М.Дж., Шахтер, Дж., Бозенберг , М., Шадель, Г.С., Баршак И., Каеч С.М., Маркел Г., Гейгер Т. Протеомика ответа меланомы на иммунотерапию выявляет митохондриальную зависимость. (2019) Cell. DOI: 10.1016 / j.cell.2019.08.012

+ развернуть аннотацию

Иммунотерапия произвела революцию в лечении рака, но большинство пациентов не реагируют на нее. Здесь мы исследовали механизмы ответа путем профилирования протеома клинических образцов от пациентов с меланомой на поздних стадиях, подвергающихся либо иммунотерапии на основе инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TIL), либо иммунотерапии против запрограммированной смерти 1 (PD1). Используя масс-спектрометрию высокого разрешения, мы количественно оценили более 10,300 4,500 белков в целом и ~ 9 белков в большинстве образцов в каждом наборе данных. Статистические анализы выявили более высокое окислительное фосфорилирование и метаболизм липидов у ответивших, чем у не ответивших на оба вида лечения. Чтобы выяснить влияние метаболического состояния на иммунный ответ, мы исследовали клетки меланомы при метаболических нарушениях или нокаутах CRISPR-CasXNUMX. Эти эксперименты показали, что метаболизм липидов является регуляторным механизмом, повышающим иммуногенность меланомы за счет повышения презентации антигена, тем самым увеличивая чувствительность к опосредованному Т-клетками уничтожению как in vitro, так и in vivo. В целом, наши протеомные анализы выявили связь между метаболическим состоянием меланомы и ответом на иммунотерапию, что может стать основой для будущего улучшения терапевтического ответа.

2018

Мангалхара, KC, Шадель, Г.С. Пептид митохондриального происхождения реализует ядерный вариант. (2018) Метаболизм клеток. 28(3):330-331. DOI: 10.1016/j.cmet.2018.08.017

+ развернуть аннотацию

Ньюман, LE, Шадель, Г.С. Pink1/Parkin связывают воспаление, митохондриальный стресс и нейродегенерацию. (2018) Журнал клеточной биологии. 217(10):3327-3329. DOI: 10.1083/jcb.201808118

+ развернуть аннотацию

Кокс, CS, Маккей, SE, Холмбек, Массачусетс, Кристиан, BE, Scortea, AC, Tsay, AJ, Newman, LE, Шадель, Г.С. Митогормезис у мышей посредством устойчивой базальной активации митохондриальной и антиоксидантной сигнализации. (2018) Метаболизм клеток. 28(5):776-786. DOI: 10.1016/j.cmet.2018.07.011

+ развернуть аннотацию

Временный митохондриальный стресс может способствовать положительным физиологическим реакциям и долголетию, что называется «митогормезисом». Чтобы изучить митогорметические пути у млекопитающих, мы создали мышей, у которых митохондриальная супероксиддисмутаза 2 (SOD2) может быть индуцируемым и обратимым образом подавлена (мыши iSOD2-KD). Истощение SOD2 только во время эмбрионального развития не вызывало постнатальной летальности, что позволило нам исследовать адаптивные ответы на митохондриальный окислительный стресс у взрослых мышей. Печень адаптированных мышей характеризовалась повышенным митохондриальным биогенезом и экспрессией антиоксидантных генов и меньшим количеством активных форм кислорода. Анализ экспрессии генов выявил неканоническую активацию антиоксиданта Nrf2 и митохондриальных сигнальных путей PPARγ/PGC-1α в этом ответе. Временный нокдаун SOD2 в эмбриональных фибробластах мышей iSOD2-KD также приводил к адаптивным митохондриальным изменениям, повышению антиоксидантной способности и устойчивости к последующему воздействию окислителей. Мы предполагаем, что митогормезис в ответ на митохондриальный окислительный стресс у мышей включает устойчивую активацию митохондриальных и антиоксидантных сигнальных путей для установления повышенного базального антиоксидантного состояния.

Ву, Л., Цао, Дж., Кай, В.Л., Ланг, С.М., Хортон, Дж.Р., Янсен, Д.Дж., Лю, З.З., Чен, Дж.Ф., Чжан, М., Мотт, Б.Т., Похида, К., Рай, Г., Калес, С.К., Хендерсон, М.Дж., Ху, Х., Джадхав, А., Мэлони, Д.Дж., Симеонов, А., Чжу, С., Ивасаки, А., Холл, М.Д., Ченг, X., Шадель, Г.С., Ян, К. Гистондеметилазы KDM5 подавляют иммунный ответ посредством подавления STING. (2018) PLOS Биология. 16(8):e2006134. DOI: 10.1371/journal.pbio.2006134

+ развернуть аннотацию

Циклическая GMP-AMP (cGAMP) синтаза (cGAS), стимулятор генов интерферона (STING), обнаруживает патогенную или аномальную собственную ДНК в цитозоле и запускает врожденную иммунную защиту от микробной инфекции и рака. Агонисты STING индуцируют как врожденный, так и адаптивный иммунный ответ и представляют собой новый класс агентов иммунотерапии рака, протестированных в многочисленных клинических испытаниях. Однако STING обычно подавляется в раковых клетках с помощью неясных механизмов, что ограничивает применение этих агонистов. Здесь мы сообщаем, что экспрессия STING эпигенетически подавляется лизиндеметилазами гистона H3K4 KDM5B и KDM5C и активируется противоположными метилтрансферазами H3K4. Индукция экспрессии STING с помощью блокады KDM5 вызывала устойчивый ответ интерферона цитозольным ДНК-зависимым образом в клетках рака молочной железы. Этот ответ привел к устойчивости к заражению ДНК- и РНК-вирусами. В опухолях человека экспрессия KDM5B обратно связана с экспрессией STING при множественных типах рака, с уровнем внутриопухолевых CD8+ Т-клеток и с выживаемостью пациентов при раке с высоким уровнем цитозольной ДНК, таком как вирус папилломы человека (ВПЧ)-положительный. рак головы и шеи. Эти результаты демонстрируют новый эпигенетический регуляторный путь иммунного ответа и позволяют предположить, что деметилазы KDM5 являются потенциальными мишенями для противопатогенного лечения и противоопухолевой иммунотерапии.

Чжан Ю., Ли Дж.Х., Полл Т.Т., Герке С., Д'Алессандро А., Доу К., Гладышев В.Н., Шредер Э.А., Стейл С.К., Кристиан Б.Е., Шадель, Г.С. Восприятие митохондриального окислительно-восстановительного потенциала с помощью киназы ATM поддерживает клеточную антиоксидантную способность. (2018) Сигнализация науки. 11(538). DOI: 10.1126/scisignal.aaq0702

+ развернуть аннотацию

Митохондрии являются неотъемлемой частью клеточного энергетического метаболизма и производства АТФ и участвуют в регуляции многих клеточных процессов. Митохондрии продуцируют активные формы кислорода (АФК), которые не только могут повреждать клеточные компоненты, но и участвуют в передаче сигнала. Киназа ATM, которая мутирует при нейродегенеративном, аутосомно-рецессивном заболевании атаксия-телеангиэктазия (AT), является ключевым игроком в реакции на повреждение ядерной ДНК. Однако ATM также выполняет окислительно-восстановительную функцию, опосредованную образованием АФК-зависимых димеров, связанных дисульфидной связью. Мы обнаружили, что пероксид водорода, полученный из митохондрий, способствует димеризации АТМ. В клетках HeLa димеры ATM были локализованы в ядре и ингибировались окислительно-восстановительным регуляторным белком thioredoxin 1 (TRX1), что свидетельствует о существовании АФК-опосредованной передачи сигналов стресса от митохондрий к ядру. Образование димера ATM не влияло на его ассоциацию с хроматином в отсутствие или при наличии повреждения ядерной ДНК, что согласуется с разделением его окислительно-восстановительных и сигнальных функций повреждения ДНК. Сравнительный анализ клеток U2OS, экспрессирующих либо ATM дикого типа, либо мутант C2991L с дефицитом окислительно-восстановительного восприятия, показал, что одной из функций окислительно-восстановительного восприятия ATM является усиление потока глюкозы через пентозофосфатный путь (PPP) за счет увеличения содержания и активности глюкозы-6. -фосфатдегидрогеназа (G6PD), тем самым увеличивая антиоксидантную способность клеток. PPP продуцирует кофермент NADPH, необходимый для надежного антиоксидантного ответа, включая регенерацию TRX1, что указывает на существование петли регуляторной обратной связи, включающей ATM и TRX1. Мы предполагаем, что потеря митохондриальной ROS-чувствительной функции ATM может вызвать клеточное накопление ROS и окислительный стресс при AT.

Кушак, А.Дж., Эспей, М.Г., Фальк, М.Дж., Холмбек, М.А., Манфреди, Г., Шадель, Г.С., Вернон, Х.Дж., Золкипли-Каннингем, З. Пищевые вмешательства при дефиците митохондриального OXPHOS: механизмы и модельные системы. (2018) Ежегодный обзор патологии. 13(163-191):163-191. DOI: 10.1146/annurev-pathol-020117-043644

+ развернуть аннотацию

Мультисистемные метаболические нарушения, вызванные дефектами окислительного фосфорилирования (ОКСФОС), являются тяжелыми, часто летальными состояниями. Врожденные нарушения функции OXPHOS называются первичными митохондриальными нарушениями (ПМН), и при их поддерживающем лечении обычно используются пищевые вмешательства. Однако детальное механистическое понимание и доказательства эффективности и безопасности этих вмешательств ограничены. Доклинические клеточные и животные модельные системы являются важными инструментами для исследования метаболических механизмов PMD и терапевтических стратегий. В этом обзоре оценивается механистическое обоснование и экспериментальные данные о нутритивных вмешательствах, обычно используемых при ПМД, включая микронутриенты, метаболические агенты, сигнальные модификаторы и регулирование питания, а также подчеркиваются важные пробелы в знаниях и препятствия для проведения рандомизированных контролируемых испытаний. Клеточные и животные модельные системы, которые воспроизводят мутации и клинические проявления конкретных PMD, оцениваются на предмет их потенциала в определении патологических механизмов, выяснении терапевтических результатов в отношении здоровья и исследовании ценности нутритивных вмешательств при митохондриальных заболеваниях.

2017

Уэст, АП, Шадель, Г.С. Митохондриальная ДНК при врожденных иммунных реакциях и воспалительной патологии. (2017) Обзоры природы. Иммунология. 17(6):363-375. DOI: 10.1038/nri.2017.21

+ развернуть аннотацию

Швеппе, Д.К., Чавес, Д.Д., Ли, К.Ф., Каудал, А., Крузе, С.Е., Штуппард, Р., Марчинек, Д.Дж., Шадель, Г.С., Тиан Р., Брюс Дж. Э. Интерактом митохондриального белка, выясненный с помощью масс-спектрометрии химического сшивания. (2017) Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 114(7):1732-1737. DOI: 10.1073/pnas.1617220114

+ развернуть аннотацию

Взаимодействия и комплексы митохондриальных белков облегчают митохондриальную функцию. Эти комплексы варьируются от простых димеров до респирасомного суперкомплекса, состоящего из комплексов окислительного фосфорилирования I, III и IV. Чтобы лучше понять функцию митохондрий, мы использовали химическую масс-спектрометрию сшивки, чтобы идентифицировать 2,427 пар сшитых пептидов из 327 митохондриальных белков в целых дышащих митохондриях мышей. Взаимодействия in situ наблюдались в белках во всех мембранных комплексах цепи переноса электронов, АТФ-синтазе и комплексе митохондриального сайта контакта и системы организации крист (MICOS). Сайты с перекрестными связями продемонстрировали превосходное соответствие эмпирическим структурам белков и предоставили дополнительные ограничения для докинга белков in silico. Эти данные установили прямые физические доказательства сборки респирасом комплекса I-III и позволили предсказать in situ межфазные области комплексов. Наконец, мы создали базу данных и инструменты для использования перекрестно-сшитых взаимодействий, которые мы наблюдали в качестве молекулярных зондов, что позволило количественно оценить интерфейсы белков, зависящие от конформации, и динамическую сборку белковых комплексов.

2016

Оран, А.Р., Адамс, К.М., Чжан, XY, Дженнаро, В.Дж., Пфайффер, Х.К., Меллерт, Х.С., Зайдель, Х.Е., Маскиоли, К., Каплан, Дж., Габалла, М.Р., Шен, К., Ригуцос, И. ., Кинг, М.П., Котни, Дж.Л., Арнольд, Дж.Дж., Шарма, С.Д., Мартинес-Аутшорн, У.Э., Вакок, Ч.Р., Ходош, Л.А., Томпсон, Дж.Е., Брэднер, Дж.Е., Кэмерон, К.Е., Шадель, Г.С., Эйшен, К.М., МакМахон, С.Б. Многоочаговый контроль экспрессии митохондриальных генов с помощью онкогенного MYC обеспечивает потенциальные терапевтические мишени при раке. (2016) Онкотаргет. 7(45):72395-72414. DOI: 10.18632/oncotarget.11718

+ развернуть аннотацию

Несмотря на повсеместную активацию при раке человека, основные нижележащие эффекторные пути фактора транскрипции MYC трудно определить и нацелить. Используя подход, основанный на структуре / функции, мы идентифицировали локус митохондриальной РНК-полимеразы (POLRMT) как критическую нижестоящую мишень MYC. Многофункциональный фермент POLRMT контролирует экспрессию митохондриальных генов, процесс, необходимый как для митохондриальной функции, так и для митохондриального биогенеза. Мы также демонстрируем, что ингибирование этого недавно определенного эффекторного пути MYC вызывает надежный и селективный апоптоз опухолевых клеток посредством острого механизма, подобного контрольной точке, связанного с аберрантной сборкой комплекса электрон-транспортной цепи и продукцией митохондриальных активных форм кислорода (АФК). К счастью, MYC-зависимая гибель опухолевых клеток может быть вызвана путем ингибирования пути экспрессии митохондриальных генов с использованием различных стратегий, включая лечение антибиотиками, одобренными FDA. Исследования in vivo с использованием мышиной модели лимфомы Беркитта предоставляют доклинические доказательства того, что эти антибиотики могут успешно блокировать прогрессирование MYC-зависимых опухолей.

Канг, МДж, Шадель, Г.С. Митохондриальная перспектива патогенеза хронической обструктивной болезни легких. (2016) Туберкулез и респираторные заболевания. 79(4):207-213. DOI: 10.4046/trd.2016.79.4.207

+ развернуть аннотацию

Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) включает в себя несколько клинических синдромов, в первую очередь эмфизему и хронический бронхит. Большинство современных методов лечения не в состоянии ослабить тяжесть и прогрессирование заболевания, что требует лучшего механистического понимания патогенеза для разработки терапии, модифицирующей заболевание. Был обнародован ряд теорий патогенеза ХОБЛ, в которых виновниками были предложены увеличение нагрузки протеаз из-за хронического воспаления, чрезмерная продукция активных форм кислорода и, как следствие, оксидантное повреждение, или избыточные реакции гибели клеток, вызванные усиленным клеточным повреждением/повреждением. Эти гипотезы не исключают друг друга и вместе, вероятно, представляют многогранные биологические процессы, участвующие в патогенезе ХОБЛ. Недавние исследования показывают, что митохондрии участвуют в передаче сигналов врожденного иммунитета, которая играет важную роль в индуцированной сигаретным дымом активации воспалений, воспалении легких и реакциях ремоделирования тканей. Эти ответы рассматриваются в настоящем документе и синтезируются с точки зрения патогенеза ХОБЛ, при этом митохондрии играют центральную роль.

Холмбек, Массачусетс, Шадель, Г.С. Митохондрии обеспечивают «комплексное» решение бактериальной проблемы. (2016) Природная иммунология. 17(9):1009-10. DOI: 10.1038/ni.3534

Ноус Дж., Госвами А.В., Бествик М., Макканн Б.Дж., Суровцева Ю.В., Шадель, Г.С. Митохондриальный рибосомный белок L12 необходим для стабильности POLRMT и существует в виде двух форм, генерируемых альтернативным протеолизом во время импорта. (2016) Журнал биологической химии. 291(2):989-97. DOI: 10.1074/jbc.M115.689299

+ развернуть аннотацию

Для трансляции 13 кодируемых мтДНК мРНК, участвующих в окислительном фосфорилировании (OXPHOS), митохондрии млекопитающих содержат специальный набор рибосом, включающий рРНК, кодируемые митохондриальным геномом, и митохондриальные рибосомные белки (MRP), которые кодируются ядерными генами и импортируются в матрикс. В дополнение к их роли в рибосоме, некоторые MRP выполняют вспомогательные функции или участвуют в других клеточных процессах, таких как регуляция клеточного цикла и апоптоз. Например, мы показали, что человеческий MRPL12 связывается и активирует митохондриальную РНК-полимеразу (POLRMT) и, следовательно, выполняет различные функции в транскрипции рибосом и мтДНК. Здесь мы предоставляем конкретные доказательства того, что существуют две зрелые формы MRPL12 млекопитающих, которые генерируются двухэтапным расщеплением во время импорта, включая эффективное расщепление митохондриальной процессинговой протеазой и второе неэффективное или регулируемое расщепление митохондриальной промежуточной протеазой. Мы также показываем, что нокдаун MRPL12 с помощью РНКи приводит к нестабильности POLRMT, но не к другим первичным компонентам митохондриальной транскрипции, и к соответствующему снижению скорости митохондриальной транскрипции. Нокдаун MRPL10, связывающего партнера MRPL12 в рибосоме, приводит к селективной деградации зрелой длинной формы MRPL12, но не влияет на POLRMT. Мы предполагаем, что две формы MRPL12 участвуют в гомеостатической регуляции митохондриальной транскрипции и биогенеза рибосом, которые, вероятно, вносят вклад в клеточный цикл, регуляцию роста и пути долголетия, с которыми был связан MRPL12.

2015

Маккей, СЭ, Ян, В., Ноус, Дж., Торманн, М.Дж., Раймундо, Н., Хан, А., Сантос-Сакки, Дж., Сонг, Л., Шадель, Г.С. Слуховая патология в модели митохондриальной глухоты у трансгенных мышей mtTFB1. (2015) Являюсь. J. Pathol. 185(12):3132-40. DOI: 10.1016/j.ajpath.2015.08.014

+ развернуть аннотацию

Мутация A1555G в гене 12S рРНК митохондриальной ДНК человека вызывает несиндромальную глухоту, наследуемую по материнской линии, крайний случай тканеспецифической митохондриальной патологии. Трансгенная линия мышей, которая сильно сверхэкспрессирует митохондриальную 12S рибосомальную РНК-метилтрансферазу TFB1M (мыши Tg-mtTFB1), демонстрирует прогрессирующую потерю слуха, которую мы предложили моделировать аспекты патологии, связанной с A1555G, у людей. Хотя наши предыдущие исследования мышей Tg-mtTFB1 выявили апоптоз в спиральном ганглии и сосудистой полоске из-за опосредованной митохондриальными активными видами кислорода активации киназы AMP (AMPK) и ядерного фактора транскрипции E2F1, детальная слуховая патология не была описана. Здесь мы показываем, что у мышей Tg-mtTFB1 снижен эндокохлеарный потенциал, что свидетельствует о значительной дисфункции сосудистых полосок, но без явных признаков атрофии полосатости. Мы также наблюдали снижение амплитуды пика 1 слухового ответа ствола мозга и удлинение латентности волны I, что согласуется с апоптозом нейронов спирального ганглия. Хотя значительной потери волосковых клеток не наблюдалось, наблюдалось легкое нарушение электроподвижности наружных волосковых клеток, зависящее от напряжения. На основании этих результатов мы предполагаем, что эти события сговорились, чтобы вызвать фенотип прогрессирующей потери слуха у мышей Tg-mtTFB1. Наконец, генетическое уменьшение AMPK α1 восстанавливает потерю слуха у мышей Tg-mtTFB1, подтверждая, что аберрантная повышающая регуляция передачи сигналов AMPK способствует наблюдаемой слуховой патологии. Обсуждается актуальность этих результатов для пациентов с A1555G и потенциальная терапевтическая ценность снижения активности AMPK.

Camell, CD, Nguyen, KY, Jurczak, MJ, Christian, BE, Shulman, GI, Шадель, Г.С., Диксит, В.Д. Макрофаг-специфический синтез церамида de Novo незаменим при воспалении, вызванном инфламмасомами, и резистентности к инсулину при ожирении. (2015) Журнал биологической химии. 290(49):29402-13. DOI: 10.1074/jbc.M115.680199

+ развернуть аннотацию

Диетическая перегрузка липидами и избыток калорий при ожирении представляют собой хроническое воспалительное состояние низкой степени тяжести со сниженной способностью надлежащим образом метаболизировать глюкозу или липиды. Макрофаги играют решающую роль в поддержании гомеостаза жировой ткани, частично регулируя метаболизм липидов, энергетический гомеостаз и ремоделирование тканей. Во время ожирения, вызванного диетой с высоким содержанием жиров, макрофаги активируются «сигналами опасности», полученными из липидов, такими как церамиды и пальмитат, и способствуют воспалению жировой ткани в зависимости от воспаления Nlrp3. Учитывая, что метаболическая судьба жирных кислот в макрофагах не полностью выяснена, мы выдвинули гипотезу, что синтез церамида de novo с помощью ограничивающего скорость фермента серинпальмитоилтрансферазы с длинной цепью (Sptlc)-2 необходим для управляемого насыщенными жирными кислотами Nlrp3. Активация инфламмасом в макрофагах. Здесь мы сообщаем, что митохондриальная направленная сверхэкспрессия каталазы, которая, как установлено, смягчает окислительный стресс, контролирует индуцированную церамидом активацию воспаления Nlrp3, но не влияет на АТФ-опосредованное расщепление каспазы-1. Удивительно, но специфичная для миелоидных клеток делеция Sptlc2 не требуется для запускаемой пальмитатом активации воспаления Nlrp3. Кроме того, удаление Sptlc2 в макрофагах не влияло на поляризацию макрофагов или вызванный ожирением лейкоцитоз жировой ткани. В соответствии с этими данными исследование резистентности к инсулину с использованием гиперинсулинемически-эугликемических зажимов не выявило существенных различий у мышей с ожирением, у которых отсутствует механизм синтеза церамида de novo в макрофагах. Эти данные свидетельствуют о том, что альтернативные метаболические пути контролируют синтез церамидов, полученных из жирных кислот, в макрофагах и активацию воспалительных процессов Nlrp3 при ожирении.

Шадель, Г.С., Хорват, TL Митохондриальная передача сигналов АФК в гомеостазе организма. (2015) Cell. 163(3):560-9. DOI: 10.1016/j.cell.2015.10.001

+ развернуть аннотацию

Лонго В.Д., Антеби А., Бартке А., Барзилай Н., Браун-Борг Х.М., Карузо К., Куриэль Т.Дж., де Кабо Р., Франчески К., Джемс Д., Ингрэм, Д.К., Джонсон, Т.Э., Кеннеди, Б.К., Кеньон, К., Клейн, С., Копчик, Дж.Дж., Леппердингер, Г., Мадео, Ф., Миризола, М.Г., Митчелл, Дж.Р., Пассарино, Г., Рудольф , КЛ, Седивы, ЮМ, Шадель, Г.С., Синклер Д.А., Шпиндлер С.Р., Сух Ю., Вийг Дж., Винчигуэрра М., Фонтана Л. Вмешательства для замедления старения человека: готовы ли мы? (2015) Стареющая клетка. 14(4):497-510. DOI: 10.1111/acel.12338

+ развернуть аннотацию

Семинар «Вмешательства для замедления старения человека: готовы ли мы?» состоялась в Эриче, Италия, 8-13 октября 2013 г., чтобы собрать вместе ведущих специалистов в области биологии и генетики старения и достичь консенсуса, связанного с открытием и разработкой безопасных вмешательств для замедления старения и увеличения продолжительности здоровой жизни человека. Был достигнут консенсус в отношении того, что имеются достаточные доказательства того, что вмешательства, направленные на старение, отсрочат и предотвратят начало многих хронических заболеваний у взрослых и в пожилом возрасте. Были определены основные пути, и появились поведенческие, диетические и фармакологические подходы. Хотя обсуждались многие генные мишени и лекарства и не было полного консенсуса по поводу всех вмешательств, участники выбрали подмножество наиболее многообещающих стратегий, которые можно было проверить на людях на предмет их влияния на продолжительность жизни. Это были: (i) диетические вмешательства, имитирующие хронические диетические ограничения (периодическое голодание, имитирующее диеты, ограничение белка и т. д.); (ii) лекарственные средства, которые ингибируют ось гормон роста/IGF-I; (iii) препараты, ингибирующие путь mTOR-S6K; или (iv) препараты, которые активируют AMPK или специфические сиртуины. Этот выбор был частично основан на непротиворечивых доказательствах эффекта увеличения продолжительности жизни и способности этих вмешательств предотвращать или отсрочивать множественные возрастные заболевания и улучшать продолжительность жизни у простых модельных организмов и грызунов, а также на их потенциальной безопасности и эффективности для увеличения продолжительности жизни человека. . Авторы этой рукописи были спикерами и участниками дискуссии, приглашенными на семинар. В нижеследующем резюме освещаются основные рассмотренные вопросы и выводы совещания.

Кан, М.Дж., Юн, К.М., Ким, Б.Х., Ли, К.М., Чжоу, Ю., Саулер, М., Гомер, Р., Дхамиджа, А., Боффа, Д., Уэст, А.П., Шадель, Г.С., Ting, JP, Tedrow, JR, Kaminski, N., Kim, WJ, Lee, CG, Oh, YM, Elias, JA Супрессия NLRX1 при хронической обструктивной болезни легких. (2015) Журнал клинических исследований. 125(6):2458-62. DOI: 10.1172/JCI71747

+ развернуть аннотацию

Сигаретный дым (CS) и вирусы способствуют воспалению и ремоделированию, связанным с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ). MAVS/RIG-I-подобный геликазный путь (MAVS/RLH) и зависимые от воспаления врожденные иммунные пути являются важными медиаторами этих ответов. На исходном уровне путь MAVS/RLH подавляется, и это ингибирование должно быть обращено вспять, чтобы вызвать тканевые эффекты; однако механизмы, которые опосредуют активацию и репрессию пути, не определены. Кроме того, регуляция и вклад передачи сигналов MAVS/RLH в индуцированные CS реакции воспаления и ремоделирования, а также в развитие ХОБЛ человека остаются нерешенными. Здесь мы демонстрируем, что экспрессия NLRX1, который ингибирует путь MAVS/RLH и регулирует другие врожденные иммунные ответы, была заметно снижена в 3 независимых когортах пациентов с ХОБЛ. Супрессия NLRX1 прямо коррелирует с тяжестью заболевания и обратно пропорционально функции легких, качеству жизни и прогнозу. В мышиных моделях CS ингибировал NLRX1, а индуцированное CS воспаление, альвеолярная деструкция, индукция протеазы, апоптоз структурных клеток и активация воспаления усиливались у животных с дефицитом NLRX1. Наоборот, дефицит MAVS устранял это индуцированное CS воспаление и ремоделирование. Восстановление NLRX1 у животных, подвергшихся воздействию КС, уменьшало разрушение альвеол. Эти данные подтверждают модель, в которой CS-зависимое ингибирование NLRX1 способствует активации MAVS/RHL и последующему воспалению, ремоделированию, протеазам, гибели клеток и воспалительным реакциям.

2014

Ронгво, А., Джексон, Р., Харман, С.С., Ли, Т., Уэст, А.П., де Зут, М.Р., Ву, Ю., Йорди, Б., Лахани, С.А., Куан, С.И., Танигучи, Т. , Шадель, Г.С., Чен З.Дж., Ивасаки А., Флавелл Р.А. Апоптотические каспазы предотвращают индукцию интерферонов I типа митохондриальной ДНК. (2014) Cell. 159(7):1563-77. DOI: 10.1016/j.cell.2014.11.037

+ развернуть аннотацию

Механизм, с помощью которого клетки подвергаются гибели, определяет, вызывают ли умирающие клетки воспалительные реакции или остаются иммунологически молчащими. Митохондрии играют центральную роль в индукции гибели клеток, а также в иммунных сигнальных путях. Здесь мы определяем механизм, с помощью которого митохондрии и нижестоящие проапоптотические каспазы регулируют активацию противовирусного иммунитета. В отсутствие активных каспаз пермеабилизация внешней мембраны митохондрий Bax и Bak приводит к экспрессии интерферонов I типа (IFN). Эта индукция опосредована митохондриальной ДНК-зависимой активацией пути cGAS/STING и приводит к установлению сильного состояния вирусной резистентности. Наши результаты показывают, что митохондрии обладают способностью одновременно выявлять внутриклеточный индуктор ответа IFN и инактивировать этот ответ зависимым от каспазы образом. Этот механизм обеспечивает двойной контроль, который определяет, инициируют ли митохондрии иммунологически молчащий или провоспалительный тип гибели клеток.

Клейтон, Д.А., Шадель, Г.С. Выделение митохондрий из клеток и тканей. (2014) Протоколы Колд-Спринг-Харбор. 2014(10):pdb.top074542. DOI: 10.1101/pdb.top074542

+ развернуть аннотацию

Клейтон, Д.А., Шадель, Г.С. Очистка митохондрий центрифугированием в ступенчатом градиенте плотности сахарозы. (2014) Протоколы Колд-Спринг-Харбор. 2014(10):pdb.prot080028. DOI: 10.1101/pdb.prot080028

+ развернуть аннотацию

Клейтон, Д.А., Шадель, Г.С. Выделение митохондрий из тканей животных. (2014) Протоколы Колд-Спринг-Харбор. 2014(10):pdb.prot080010. DOI: 10.1101/pdb.prot080010

+ развернуть аннотацию

Клейтон, Д.А., Шадель, Г.С. Выделение митохондрий из клеток культуры тканей. (2014) Протоколы Колд-Спринг-Харбор. 2014(10):pdb.prot080002. DOI: 10.1101/pdb.prot080002

+ развернуть аннотацию

Ноус, Дж., Шадель, Г.С. микроуправление митохондриальной трансляцией. (2014) Cell. 158(3):477-8. DOI: 10.1016/j.cell.2014.07.010

+ развернуть аннотацию

Шадель, Г.С. Живите дольше на MARS: дрожжевая парадигма митохондриальной адаптивной передачи сигналов АФК при старении. (2014) Микробная клетка. 1(5):140-144. DOI: 10.15698/mic2014.05.143

+ развернуть аннотацию

Маннам, П., Шинн, А.С., Сривастава, А., Неаму, Р.Ф., Уокер, В.Е., Боханон, М., Меркель, Дж., Канг, М.Дж., Дела Круз, К.С., Ахасик, А.М., Писани, М.А., Тренталанж , М., Западный, АП, Шадель, Г.С., Элиас, Дж. А., Ли, П. Дж. MKK3 регулирует митохондриальный биогенез и митофагию при сепсис-индуцированном повреждении легких. (2014) Являюсь. Дж. Физиол. Мол.клеток легких. Физиол. 306(7):L604-19. DOI: 10.1152/ajplung.00272.2013

+ развернуть аннотацию

Сепсис является системной воспалительной реакцией на инфекцию и основной причиной смерти во всем мире. Поскольку специфические методы лечения сепсиса ограничены, а лежащий в его основе патогенез неясен, текущая медицинская помощь остается исключительно поддерживающей. Поэтому необходимо разработать таргетную терапию для лечения сепсиса. Хотя считается, что важным медиатором сепсиса является митохондриальная дисфункция, лежащий в ее основе молекулярный механизм неясен. Модуляция митохондриальных процессов может быть эффективной терапевтической стратегией при сепсисе. Здесь мы исследовали роль киназы MKK3 в регуляции митохондриальной функции при сепсисе. Используя клинически значимые модели животных, мы исследовали функцию митохондрий в первичных эндотелиальных клетках легких мыши, подвергшихся воздействию ЛПС. Дефицит MKK3 снижает летальность от сепсиса у мышей и за счет снижения уровня повреждения легких и митохондрий, а также активных форм кислорода. Кроме того, дефицит MKK3, по-видимому, одновременно увеличивает митохондриальный биогенез и митофагию за счет действия Sirt1, Pink1 и Parkin. Это привело к созданию более надежной митохондриальной сети, которая, как мы предлагаем, обеспечивает защиту от сепсиса. Мы также обнаружили более высокую активацию MKK3 в изолированных мононуклеарных клетках периферической крови пациентов с сепсисом по сравнению с контрольной группой без сепсиса. Наши результаты демонстрируют критическую роль митохондрий в патогенезе сепсиса, который включает ранее неизвестную функцию MKK3 в контроле качества митохондрий. Этот митохондриальный путь может помочь выявить новые диагностические маркеры и терапевтические мишени против сепсиса.

Кристиан, BE, Шадель, Г.С. Старение: восстановить митохондриальную дисфункцию возможно. (2014) Текущая биология. 24(5):R206-8. DOI: 10.1016/j.cub.2014.01.027

+ развернуть аннотацию

Шредер, Э.А., Шадель, Г.С. Перекрестные помехи между сигналами митохондриального стресса регулируют хронологическую продолжительность жизни дрожжей. (2014) Мех. Старение Dev. 135:41-9. DOI: 10.1016/j.mad.2013.12.002

+ развернуть аннотацию

Митохондриальная ДНК (мтДНК) существует в нескольких копиях на клетку и необходима для окислительного фосфорилирования. Истощенная или мутированная мтДНК способствует развитию многих заболеваний человека и может способствовать старению. Снижение передачи сигналов TORC1 у почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae частично увеличивает хронологическую продолжительность жизни (CLS) за счет генерации сигнала митохондриальных АФК (mtROS), который эпигенетически изменяет экспрессию ядерных генов. Чтобы удовлетворить потенциальную потребность в поддержании мтДНК в этом ответе, мы проанализировали штаммы, лишенные митохондриального фермента восстановления эксцизии оснований Ntg1p. Расширение CLS за счет передачи сигналов mtROS и снижение активности TORC1, но не ограничение калорийности, было отменено в штаммах ntg1Δ, которые демонстрировали истощение мтДНК без дефектов дыхания. Реакция на повреждение ДНК (DDR) киназа Rad53p, которая передает сигналы mtROS, увеличивающие продолжительность жизни, также активируется в штаммах ntg1Δ. Восстановление количества копий мтДНК облегчало активацию Rad53p и восстанавливало удлинение CLS после передачи сигналов mtROS, указывая на то, что Rad53p непосредственно ощущает истощение мтДНК. Наконец, DDR-киназы регулируют динамику ядерно-митохондриальной локализации Ntg1p. Из этих результатов мы делаем вывод, что путь DDR ощущает и может регулировать Ntg1p-зависимую стабильность мтДНК. Кроме того, Rad53p воспринимает множественные митохондриальные стрессы иерархическим образом, чтобы вызвать специфические физиологические результаты, примером которых является истощение мтДНК, преобладающее над способностью Rad53p передавать адаптивный сигнал долголетия mtROS.

Шарма Н.К., Лебедева М., Томас Т., Коваленко О.А., Штумпф Ю.Д., Шадель, Г.С., Сантос, Дж. Х. Внутренние дефекты репарации митохондриальной ДНК при атаксии телеангиэктазии. (2014) Восстановление ДНК. 13:22-31. DOI: 10.1016/j.dnarep.2013.11.002

+ развернуть аннотацию

Атаксия-телеангиэктазия (АТ) — прогрессирующее детское заболевание, характеризующееся прежде всего дегенерацией мозжечка и предрасположенностью к раку. AT вызывается мутациями киназы ATM, основного регулятора реакции на двухцепочечный разрыв ДНК. В дополнение к дефектам передачи сигналов о повреждении ДНК, AT-клетки демонстрируют митохондриальную дисфункцию, которая, как считается, способствует патогенезу AT. Однако молекулярный механизм, приводящий к митохондриальной дисфункции при AT, остается неясным. Здесь мы показываем, что отсутствие АТМ приводит к снижению целостности митохондриальной ДНК (мтДНК) и митохондриальной дисфункции, которые связаны с дефектной репарацией мтДНК. В то время как уровни белков репарации мтДНК в основном нормальные, в отсутствие уровней ATM, в частности, ДНК-лигазы III (Lig3), единственная ДНК-лигаза, работающая в митохондриях, снижается. Снижение уровня Lig3 наблюдается в различных клетках пациентов с АТ, в клетках головного мозга и пре-В-клетках, полученных от мышей с нокаутом по АТМ, а также при временном или стабильном нокдауне по АТМ. Кроме того, фармакологическое ингибирование Lig3 в клетках дикого типа фенокопирует дефекты репарации мтДНК, наблюдаемые в клетках пациентов с АТ. Поскольку направленная делеция LIG3 в центральной нервной системе вызывает изнурительную атаксию у мышей, снижение уровня белка Lig3 и последующий дефект репарации мтДНК могут способствовать нейродегенерации АТ. Таким образом, AT является первым заболеванием, характеризующимся сниженным уровнем Lig3.

2013

Шредер Э.А., Раймундо Н., Шадель, Г.С. Эпигенетическое молчание опосредует вызванное стрессом долголетие митохондрий. (2013) Метаболизм клеток. 17(6):954-64. DOI: 10.1016/j.cmet.2013.04.003

+ развернуть аннотацию

Активные формы кислорода (АФК) играют сложную роль в старении, оказывая как повреждающее действие, так и сигнальные функции. Кратковременное повышение митохондриального стресса, включая митохондриальные АФК (мтАФК), вызывает благоприятные реакции, увеличивающие продолжительность жизни. Однако эти адаптивные сигнальные пути долголетия остаются плохо изученными. Здесь мы показываем, что Tel1p и Rad53p, гомологи киназ ATM и Chk2, отвечающих за реакцию на повреждение ДНК млекопитающих, опосредуют гормональный сигнал долголетия mtROS, который увеличивает хронологическую продолжительность жизни дрожжей. Этот путь воспринимает mtROS способом, отличным от реакции на повреждение ядерной ДНК, и, в конечном счете, обеспечивает долголетие за счет инактивации гистоновой деметилазы Rph1p специфически в субтеломерном гетерохроматине, усиления связывания сайленсингового белка Sir3p и репрессии субтеломерной транскрипции. Эти результаты демонстрируют существование консервативных путей передачи сигналов стресса от митохондрий к ядру, которые регулируют старение посредством эпигенетической модуляции экспрессии ядерных генов.

Бествик, МЛ, Шадель, Г.С. Аксессуаризация митохондриальной транскрипционной машины человека. (2013) Тенденции биохимических наук. 38(6):283-91. DOI: 10.1016/j.tibs.2013.03.006

+ развернуть аннотацию

Суровцева Ю.В., Шадель, Г.С. Независимая от транскрипции роль митохондриальной РНК-полимеразы человека в биогенезе митохондриальных рибосом. (2013) Исследования нуклеиновых кислот. 41(4):2479-88. DOI: 10.1093/нар/gks1447

+ развернуть аннотацию

Митохондриальная РНК-полимераза человека, POLRMT, необходима для транскрипции митохондриальной ДНК (мтДНК) и образует комплексы инициации с человеческим митохондриальным фактором транскрипции B2 (h-mtTFB2). Однако POLRMT также взаимодействует с паралогом h-mtTFB2, h-mtTFB1, который представляет собой 12S рибосомальную РНК-метилтрансферазу, необходимую для сборки малых (28S) митохондриальных рибосомных субъединиц. Здесь мы показываем, что POLRMT связывается с h-mtTFB1 в митохондриальных рибосомных комплексах 28S, которые стабильны в отсутствие митохондриальной транскрипции и отличаются от транскрипционных комплексов, содержащих POLRMT и h-mtTFB2. Сверхэкспрессия POLRMT в клетках HeLa увеличивает метилирование 12S рРНК с помощью h-mtTFB1 и снижает стационарные уровни кодируемых мтДНК белков и дыхания, по-видимому, из-за снижения количества полностью собранных 55S митохондриальных рибосом. Мы предполагаем, что POLRMT взаимодействует непосредственно с h-mtTFB1 в митохондриальных рибосомах 28S, чтобы увеличить его активность метилтрансферазы 12S рРНК, и что вместе они обеспечивают контрольную точку для правильной сборки 28S и 55S митохондриальных рибосом. Т.о., POLRMT является многофункциональным, образуя отдельные белковые комплексы, которые регулируют различные этапы экспрессии митохондриальных генов, по крайней мере один из которых не включает транскрипцию per se. Значение этих результатов обсуждается в отношении механизма и регуляции экспрессии митохондриальных генов человека и потенциальной многофункциональности РНК-полимераз в целом.

2012

Окампо А., Лю Дж., Шредер Э.А., Шадель, Г.С., Баррьентос, А. Митохондриальные дыхательные пороги регулируют хронологическую продолжительность жизни дрожжей и ее увеличение за счет ограничения калорийности. (2012) Метаболизм клеток. 16(1):55-67. DOI: 10.1016/j.cmet.2012.05.013

+ развернуть аннотацию

Мы исследовали роль митохондриальной функции в старении путем генетической и фармакологической модификации производства дрожжевого клеточного дыхания во время экспоненциальной и/или стационарной фаз роста и определения того, как это влияет на хронологическую продолжительность жизни (ХПЖ). Наши результаты показывают, что дыхание необходимо во время обеих фаз роста для стандартного CLS, но что дрожжи обладают большой дыхательной способностью, и только дефицит ниже порогового значения (~ 40% от дикого типа) значительно снижает CLS. Расширение CLS за счет ограничения калорий также требовало дыхания выше аналогичного порога во время экспоненциального роста и полностью устраняло потребность в дыхании в стационарной фазе. Наконец, мы показываем, что добавление в среду 1% трегалозы, запасного углевода, восстанавливает CLS дикого типа в респираторно-нулевых клетках. Мы заключаем, что митохондриальные дыхательные пороги регулируют CLS дрожжей и его расширение за счет ограничения калорийности за счет повышения стрессоустойчивости, важным компонентом которой является оптимальное накопление и мобилизация запасов питательных веществ.

Лонго В.Д., Шадель, Г.С., Каберляйн М., Кеннеди Б. Репликативное и хронологическое старение Saccharomyces cerevisiae. (2012) Метаболизм клеток. 16(1):18-31. DOI: 10.1016/j.cmet.2012.06.002

+ развернуть аннотацию

Лодейро, М.Ф., Учида, А., Бествик, М., Мустафа, И.М., Арнольд, Дж.Дж., Шадель, Г.С., Кэмерон, CE Транскрипция со второго промотора тяжелой цепи мтДНК человека репрессируется транскрипционным фактором А in vitro. (2012) Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 109(17):6513-8. DOI: 10.1073/pnas.1118710109

+ развернуть аннотацию

Исследования на клетках подтверждают существование двух промоторов тяжелой цепи мтДНК: промотора тяжелой цепи 1 (HSP1) и HSP2. Однако о транскрипции из HSP2 сообщалось только один раз в бесклеточной системе и ни разу, когда использовались рекомбинантные белки. Здесь мы документируем транскрипцию HSP2 с использованием системы определенного состава in vitro. Олигонуклеотидной матрицы, представляющей положения 596-685 мтДНК, было достаточно для наблюдения за транскрипцией человеческой мтРНК-полимеразой (POLRMT), которая полностью зависела от митохондриального фактора транскрипции B2 (TFB2M). POLRMT/TFB2M-зависимая транскрипция ингибировалась концентрациями митохондриального фактора транскрипции A (TFAM), стехиометрическими с матрицей транскрипции, условием, которое активирует транскрипцию с промотора легкой цепи (LSP) in vitro. Домены TFAM, необходимые для активации LSP, также необходимы для репрессии HSP2, тогда как др. связывающие мтДНК белки не способны изменять выход транскрипции. Сайты связывания TFAM были расположены по обе стороны от стартового сайта транскрипции HSP2, что свидетельствует о том, что связывание TFAM препятствует связыванию POLRMT и/или TFB2M. В соответствии с моделью конкурентного связывания для TFAM-репрессии HSP2 влияние концентрации TFAM на транскрипцию HSP2 уменьшалось за счет повышения концентраций POLRMT и TFB2M. В контексте наших предыдущих исследований LSP и HSP1 теперь ясно, что в мтДНК человека существуют три промотора. Каждый промотор имеет уникальную потребность и/или ответ на уровень присутствующего TFAM, таким образом подразумевая гораздо большую сложность в регуляции митохондриальной транскрипции млекопитающих, чем признано на сегодняшний день.

Шредер, Э.А., Шадель, Г.С. Альтернативное митохондриальное топливо увеличивает продолжительность жизни. (2012) Метаболизм клеток. 15(4):417-8. DOI: 10.1016/j.cmet.2012.03.011

+ развернуть аннотацию

Раймундо, Н., Сонг, Л., Шатт, Т.Э., Маккей, С.Э., Котни, Дж., Гуан, М.Х., Гиллиленд, Т.С., Хохуан, Д., Сантос-Сакки, Дж., Шадель, Г.С. Митохондриальный стресс задействует апоптозную передачу сигналов E2F1, вызывая глухоту. (2012) Cell. 148(4):716-26. DOI: 10.1016/j.cell.2011.12.027

+ развернуть аннотацию

Митохондриальная дисфункция вызывает плохо изученную тканеспецифическую патологию, возникающую из-за первичных дефектов дыхания в сочетании с измененными активными формами кислорода (АФК), метаболической передачей сигналов и апоптозом. Мутация мтДНК A1555G, которая вызывает наследуемую по материнской линии глухоту, нарушает функцию митохондриальных рибосом, частично за счет повышенного метилирования митохондриальной 12S рРНК метилтрансферазой mtTFB1. В клетках A1555G, полученных от пациентов, мы показываем, что гиперметилирование 12S рРНК вызывает ROS-зависимую активацию киназы AMP и проапоптотического ядерного фактора транскрипции E2F1. Это ретроградное реле митохондриального стресса действует in vivo, поскольку у трансгенных мышей mtTFB1 наблюдается усиленное метилирование 12S рРНК во многих тканях, повышенный E2F1 и апоптоз в полосатых сосудах и нейронах спирального ганглия внутреннего уха, а также прогрессирующая E2F1-зависимая потеря слуха. Эта модель митохондриального заболевания у мышей обеспечивает надежную платформу для расшифровки сложной тканевой специфичности митохондриальных заболеваний человека, а также точного патогенетического механизма материнской наследственной глухоты и ее обострения факторами окружающей среды.

Ву, Д.К., Грин, П.Д., Сантос, Д.Х., Д'Суза, А.Д., Вальтер, З., Мартин, В.Д., Кристиан, Б.Е., Чандел, Н.С., Шадель, Г.С. Нестабильность митохондриального генома и АФК усиливают онкогенез кишечника у мышей APC(Min/+). (2012) Являюсь. J. Pathol. 180(1):24-31. DOI: 10.1016/j.ajpath.2011.10.003

+ развернуть аннотацию

Изменения в митохондриальном окислительном фосфорилировании давно задокументированы в опухолях. Другие типы митохондриальной дисфункции, включая измененную продукцию активных форм кислорода (АФК) и апоптоз, также могут способствовать онкогенезу и фенотипам рака. Кроме того, в раковых клетках наблюдались мутации и измененные количества митохондриальной ДНК (мтДНК). Однако то, как нестабильность мтДНК сама по себе способствует развитию рака, остается в значительной степени неясным. Митохондриальный транскрипционный фактор А (TFAM) необходим для экспрессии и поддержания мтДНК. Гетерозиготные мыши с нокаутом Tfam (Tfam(+/-)) демонстрируют умеренное истощение мтДНК, но не имеют явных фенотипов. Мы показываем, что мышиные клетки и ткани Tfam(+/-) не только обладают меньшим количеством мтДНК, но и повышенным окислительным повреждением мтДНК. Скрещивание мышей Tfam(+/-) с моделью рака мышей с аденоматозным полипозом толстой кишки и множественной неоплазией кишечника (APC(Min/+)) показало, что нестабильность мтДНК увеличивает количество опухолей и их рост в тонкой кишке. Это не было результатом усиления передачи сигналов Wnt/β-catenin, а, скорее, по-видимому, связано со склонностью к увеличению продукции митохондриальных АФК. Прямое участие митохондриальных АФК в онкогенезе кишечника было показано путем скрещивания мышей APC(Min/+) с теми, у которых каталаза нацелена на митохондрии, что привело к значительному снижению онкогенеза в толстой кишке. Таким образом, нестабильность митохондриального генома и АФК усиливают онкогенез кишечника, и мыши Tfam(+/-) являются подходящей моделью для изучения роли нестабильности мтДНК в болезненных состояниях, в которые вовлечена митохондриальная дисфункция, таких как рак, нейродегенерация и старение.

Маларки, К.С., Бествик, М., Кульвильм, Дж. Э., Шадель, Г.С., Черчилль, Мэн Активация транскрипции митохондриальным фактором транскрипции А включает предпочтительное искажение промоторной ДНК. (2012) Исследования нуклеиновых кислот. 40(2):614-24. DOI: 10.1093/нар/gkr787

+ развернуть аннотацию

Митохондриальный транскрипционный фактор А (mtTFA/TFAM) представляет собой кодируемый ядром белок с высокой подвижностью групповой коробки (HMG-box), который регулирует транскрипцию митохондриального генома путем специфического распознавания промоторов легкой и тяжелой цепи (LSP, HSP1). ). TFAM также связывает митохондриальную ДНК не специфичным к последовательности (NSS) способом и облегчает ее упаковку в нуклеоидные структуры. Однако необходимость и вклад изгибания ДНК для этих двух различных способов связывания подробно не рассматривались, что побудило провести сравнение свойств связывания и изгиба TFAM на промоторной и непромоторной ДНК. Промоторная ДНК увеличивала стабильность TFAM в большей степени, чем непромоторная ДНК. Однако термодинамические свойства связывания ДНК для TFAM с промотором и неспецифической (NS) ДНК были сходны друг с другом и с другими белками NSS HMG-box. Анализ переноса энергии флуоресцентного резонанса показал, что TFAM изгибает промоторную ДНК в большей степени, чем NS ДНК. Напротив, TFAM, лишенный С-концевого хвоста, искажает как промоторную, так и непромоторную ДНК в значительно меньшей степени, что соответствует заметному снижению способности активации транскрипции в LSP и HSP1 in vitro. Таким образом, усиленное изгибание промоторной ДНК, придаваемое С-концевым хвостом, является критическим компонентом способности TFAM активировать специфичную для промотора инициацию с помощью основного митохондриального аппарата транскрипции.

2011

Лю Л., Саносака М., Лей С., Бествик М.Л., Фрей Дж.Х., Суровцева Ю.В., Шадель, Г.С., Купер, член парламента Белок LRP130 ремоделирует митохондрии и стимулирует окисление жирных кислот. (2011) Журнал биологической химии. 286(48):41253-64. DOI: 10.1074/jbc.M111.276121

+ развернуть аннотацию

Нарушение окислительного фосфорилирования (OXPHOS) связано с несколькими метаболическими нарушениями. Хотя митохондриальная ДНК кодирует несколько субъединиц, критических для OXPHOS, метаболические последствия активации митохондриальной транскрипции остаются неясными. Здесь мы показываем, что LRP130, белок, участвующий в синдроме Лея, увеличивает окисление β-жирных кислот в печени. Используя конвергентные генетические и биохимические подходы, мы демонстрируем комплексы LRP130 с митохондриальной РНК-полимеразой для активации митохондриальной транскрипции. Активация митохондриальной транскрипции связана с повышенной активностью OXPHOS, увеличением количества суперкомплексов и более плотными кристами, независимо от митохондриального биогенеза. В соответствии с усилением окислительного фосфорилирования уровни АТФ повышаются как в клетках, так и в печени мышей, тогда как парное дыхание увеличивается в клетках. Мы предполагаем, что активация митохондриальной транскрипции ремоделирует митохондрии и усиливает окислительный метаболизм.

Суровцева Ю.В., Шатт Т.Е., Котни Дж., Симен Х., Чен С.Ю., Коч Е.С., Шадель, Г.С. Митохондриальный рибосомный белок L12 избирательно связывается с митохондриальной РНК-полимеразой человека для активации транскрипции. (2011) Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 108(44):17921-6. DOI: 10.1073/pnas.1108852108

+ развернуть аннотацию

Базальная транскрипция митохондриальной ДНК человека (мтДНК) in vitro требует односубъединичной РНК-полимеразы, родственной бактериофагу, POLRMT и транскрипционного фактора h-mtTFB2. Эта двухкомпонентная система по-разному активируется на промоторах мтДНК человеческим митохондриальным транскрипционным фактором А (h-mtTFA). Митохондриальный рибосомный белок L7/L12 (MRPL12) связывается непосредственно с POLRMT, но неизвестно, делает ли он это в контексте рибосомы или как «свободный» белок в матрице. Кроме того, существующие доказательства того, что MRPL12 активирует митохондриальную транскрипцию, получены из исследований сверхэкспрессии в культивируемых клетках и экспериментов по транскрипции с использованием неочищенных митохондриальных лизатов, что исключает прямое влияние MRPL12 на транскрипцию. Здесь мы сообщаем, что истощение MRPL12 из клеток HeLa с помощью shRNA приводит к снижению устойчивых уровней митохондриальных транскриптов, которые не объясняются изменениями стабильности РНК. Мы также показываем, что значительный «свободный» пул MRPL12 существует в митохондриях человека, не связанных с рибосомами. «Свободный» MRPL12 избирательно связывается с POLRMT in vivo в виде комплекса, отличного от тех, которые содержат h-mtTFB2. Наконец, используя полностью рекомбинантную митохондриальную систему транскрипции, мы демонстрируем, что MRPL12 стимулирует промотор-зависимую и промотор-независимую транскрипцию непосредственно in vitro. Основываясь на этих результатах, мы предполагаем, что, когда MRPL12 не связан с рибосомами, он выполняет вторую функцию в транскрипции, возможно, облегчая переход от инициации к элонгации. Мы предполагаем, что это один из механизмов координации биогенеза митохондриальных рибосом и транскрипции в митохондриях человека, где транскрипция рРНК из мтДНК, по-видимому, должна регулироваться в соответствии со скоростью импорта и сборки кодируемых ядром MRP в рибосомы.

Байсал Б.Е., Маккей С.Е., Ким Ю.Дж., Чжан З., Алила Л., Уиллетт-Брозик Д.Е., Пачак К., Ким Т.Х., Шадель, Г.С. Геномный импринтинг на граничном элементе, примыкающем к локусу SDHD. (2011) Молекулярная генетика человека. 20(22):4452-61. DOI: 10.1093/hmg/ddr376

+ развернуть аннотацию

Мутации зародышевой линии в SDHD, гене субъединицы митохондриального комплекса II (сукцинатдегидрогеназа) в полосе хромосомы 11q23, вызывают опухоли параганглиомы с высокой проникающей способностью (PGL) при передаче от отца. Напротив, материнская передача редко, если вообще когда-либо, приводит к развитию опухоли. Механизм, лежащий в основе этого необычного паттерна предрасположенности к моногенным опухолям, плохо изучен. Здесь мы описываем идентификацию импринтированного метилирования в альтернативном промоторе для большой межгенной некодирующей РНК, расположенной на границе отдаленной генной пустыни, граничащей с SDHD. Метилирование в этом сайте в основном происходит в пределах двух последовательных сайтов рестрикционных ферментов HpaII тканеспецифическим образом, чаще всего в надпочечниках. Информативные ткани плода и опухоли PGL демонстрируют гиперметилирование материнских аллелей. В то время как сильный сайт связывания белка CTCF, блокирующего энхансер, в альтернативном промоторе не показывает признаков метилирования, гиперметилированные ткани надпочечников демонстрируют повышенное связывание фактора когезина, образующего петлю хроматина, по сравнению с гипометилированными тканями. Эти результаты предполагают, что дифференциальное аллельное метилирование, которое мы наблюдаем в этом локусе, связано с измененной архитектурой хроматина. Эти результаты предоставляют молекулярные доказательства импринтинга в граничном элементе, граничащем с локусом SDHD, и позволяют предположить, что эпигенетическая супрессия материнского аллеля является основным механизмом импринтинговой пенетрантности мутаций SDHD.

Раймундо Н., Байсал Б.Е., Шадель, Г.С. Возвращаясь к циклу ТСА: сигнализация образования опухоли. (2011) Тенденции в молекулярной медицине. 17(11):641-9. DOI: 10.1016/j.molmed.2011.06.001

+ развернуть аннотацию

Пан Ю., Шредер Э.А., Окампо А., Баррьентос А., Шадель, Г.С. Регуляция хронологической продолжительности жизни дрожжей с помощью TORC1 посредством адаптивной митохондриальной передачи сигналов АФК. (2011) Метаболизм клеток. 13(6):668-78. DOI: 10.1016/j.cmet.2011.03.018

+ развернуть аннотацию

Здесь мы показываем, что штаммы дрожжей со сниженной целью передачи сигналов рапамицина (TOR) имеют более высокую общую активность митохондриальной цепи переноса электронов во время роста, которая эффективно связана с продукцией АТФ. Это метаболическое изменение увеличивает потенциал митохондриальной мембраны и выработку активных форм кислорода (АФК), что, как мы предполагаем, обеспечивает адаптивный сигнал во время роста, который увеличивает хронологическую продолжительность жизни (ХПЖ). В подтверждение этой концепции разобщение дыхания во время роста или увеличение экспрессии митохондриальной марганцевой супероксиддисмутазы значительно снижает удлинение CLS в штаммах tor1Δ, а обработка штаммов дикого типа либо рапамицином (для ингибирования TORC1), либо менадионом (для создания митохондриальных АФК). во время роста достаточно продлить CLS. Наконец, расширение CLS за счет снижения TORC1/Sch9p-митохондриальной передачи сигналов происходит независимо от Rim15p и не является функцией изменений подкисления/состава среды. Учитывая сохранение эффектов TOR-пути на продолжительность жизни, митохондриальная передача сигналов ROS может быть важным механизмом регуляции долголетия у высших организмов.

Уэст, АП, Шадель, Г.С., Гош, С. Митохондрии в реакциях врожденного иммунитета. (2011) Обзоры природы. Иммунология. 11(6):389-402. DOI: 10.1038/nri2975

+ развернуть аннотацию

Шатене-Лапуант, М., Шадель, Г.С. Репрессия митохондриальной трансляции, дыхания и гена, регулирующего метаболический цикл, SLF1, дрожжевым белком семейства Pumilio Puf3p. (2011) PLOS One. 6(5):e20441. DOI: 10.1371/journal.pone.0020441

+ развернуть аннотацию

Для синтеза и сборки системы митохондриального окислительного фосфорилирования (OXPHOS) необходимы гены, расположенные как в ядерном, так и в митохондриальном геномах, но то, как экспрессия генов координируется между этими двумя компартментами, до конца не изучено. Один уровень контроля осуществляется посредством регулируемой экспрессии митохондриальных рибосомных белков и других факторов, необходимых для митохондриальной трансляции и сборки OXPHOS, которые являются продуктами ядерных генов, которые впоследствии импортируются в митохондрии. Интересно, что этот набор генов у почкующихся дрожжей имеет общий элемент 3'-UTR, который связан с белком семейства Pumilio, Puf3p, и координировано регулируется во многих условиях, в том числе во время метаболического цикла дрожжей. Puf3p приписывается множество функций, в том числе содействие деградации мРНК, локализация митохондриальных транскриптов, кодируемых ядром, на внешней митохондриальной мембране и облегчение митохондриально-цитоскелетных взаимодействий и подвижности. Здесь мы показываем, что Puf3p оказывает общее репрессивное действие на изобилие, трансляцию и дыхание митохондриального OXPHOS, которое не связано с изменениями в общем митохондриальном биогенезе и в значительной степени не зависит от TORC1-митохондриальной передачи сигналов. Мы также идентифицировали цитоплазматический фактор трансляции Slf1p как ген, регулирующий метаболический цикл дрожжей, который репрессируется Puf3p на посттранскрипционном уровне и способствует дыханию и увеличению хронологической продолжительности жизни дрожжей при сверхэкспрессии. В целом, эти результаты должны облегчить будущие исследования того, какая из многих функций Puf3p наиболее актуальна для регуляции экспрессии митохондриальных генов и роли ядерно-митохондриальной коммуникации в старении и долголетии.

Уэст, А.П., Бродский, И.Е., Ранер, К., Ву, Д.К., Эрджумент-Бромаж, Х., Темпст, П., Уолш, М.С., Чой, Ю., Шадель, Г.С., Гош, С. Передача сигналов TLR усиливает бактерицидную активность макрофагов посредством митохондриальных АФК. (2011) Природа. 472 (7344): 476-80. DOI: 10.1038/nature09973

+ развернуть аннотацию

Активные формы кислорода (АФК) являются важными компонентами врожденного иммунного ответа против внутриклеточных бактерий, и считается, что профессиональные фагоциты генерируют АФК главным образом с помощью фагосомального НАДФН-оксидазного механизма. Однако недавние исследования показали, что митохондриальные АФК (мАФК) также способствуют бактерицидной активности мышиных макрофагов, хотя механизмы, связывающие врожденную иммунную передачу сигналов с митохондриями для образования мАФК, остаются неясными. Здесь мы демонстрируем, что вовлечение подмножества Toll-подобных рецепторов (TLR1, TLR2 и TLR4) приводит к привлечению митохондрий к фагосомам макрофагов и увеличению продукции mROS. Этот ответ включает транслокацию сигнального адаптера TLR, фактора 6, ассоциированного с рецептором фактора некроза опухоли (TRAF6), в митохондрии, где он взаимодействует с белком ECSIT (эволюционно законсервированным сигнальным промежуточным продуктом в путях Toll), который участвует в сборке митохондриальной дыхательной цепи. Взаимодействие с TRAF6 приводит к убиквитинированию и обогащению ECSIT на периферии митохондрий, что приводит к увеличению образования митохондриальных и клеточных АФК. ECSIT- и TRAF6-истощенные макрофаги имеют пониженные уровни TLR-индуцированных АФК и значительно снижены их способности убивать внутриклеточные бактерии. Кроме того, снижение уровня mROS в макрофагах за счет экспрессии каталазы в митохондриях приводит к нарушению уничтожения бактерий, что подтверждает роль mROS в бактерицидной активности. Эти результаты раскрывают новый путь, связывающий передачу сигналов врожденного иммунитета с митохондриями, указывают на то, что mROS является важным компонентом антибактериальных ответов, и дополнительно устанавливают митохондрии в качестве центров передачи сигналов врожденного иммунитета.

Шатт Т.Е., Бествик М., Шадель, Г.С. Основной митохондриальный комплекс инициации транскрипции человека: для танго нужны только двое. (2011) Транскрипция. 2(2):55-59. DOI: 10.4161/trns.2.2.14296

+ развернуть аннотацию

Ву, ДК, Шадель, Г.С. Сигналы митохондриального стресса пересматривают старую теорию старения. (2011) Cell. 144(1):11-2. DOI: 10.1016/j.cell.2010.12.023

+ развернуть аннотацию

2010

Lee, HY, Choi, CS, Birkenfeld, AL, Alves, TC, Jornayvaz, FR, Jurczak, MJ, Zhang, D., Woo, DK, Шадель, Г.С., Ладиджес В., Рабинович П.С., Сантос Дж.Х., Петерсен К.Ф., Самуэль В.Т., Шульман Г.И. Направленная экспрессия каталазы в митохондриях предотвращает возрастное снижение функции митохондрий и резистентность к инсулину. (2010) Метаболизм клеток. 12(6):668-74. DOI: 10.1016/j.cmet.2010.11.004

+ развернуть аннотацию

Было высказано предположение, что связанная со старением резистентность мышц к инсулину связана со снижением митохондриальной функции, вторичной по отношению к кумулятивному повреждению свободными радикалами, что приводит к увеличению внутримиоцеллюлярного содержания липидов. Чтобы непосредственно проверить эту гипотезу, мы исследовали митохондриальную функцию как in vivo, так и in vitro, содержание внутримиоцеллюлярных липидов и действие инсулина у худых здоровых мышей с целенаправленной сверхэкспрессией гена каталазы человека в митохондриях (мыши MCAT). Здесь мы показываем, что мыши MCAT защищены от возрастного снижения функции митохондрий мышц (~30%), энергетического метаболизма (~7%) и индуцированной липидами резистентности мышц к инсулину. Эта защита от вызванного возрастом снижения митохондриальной функции была связана со снижением митохондриального окислительного повреждения, сохранением митохондриального дыхания и синтеза АТФ в мышцах, а также митохондриальным биогенезом, индуцированным АМФ-активируемой протеинкиназой. Взятые вместе, эти данные свидетельствуют о том, что сохраненная функция митохондрий, поддерживаемая за счет уменьшения митохондриального окислительного повреждения, может предотвратить возрастной энергетический дисбаланс всего тела и резистентность мышц к инсулину.

Шатене-Лапуант, М., Шадель, Г.С. Митохондрии в состоянии стресса становятся ЗУМНЫМИ. (2010) Метаболизм клеток. 12(6):559-60. DOI: 10.1016/j.cmet.2010.11.018

+ развернуть аннотацию

Шатт, Т.Е., Лодейро, М.Ф., Котни, Дж., Кэмерон, К.Е., Шадель, Г.С. Основной аппарат митохондриальной транскрипции человека представляет собой регулируемую двухкомпонентную систему in vitro. (2010) Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 107(27):12133-8. DOI: 10.1073/pnas.0910581107

+ развернуть аннотацию

Основной аппарат митохондриальной транскрипции человека в настоящее время рассматривается как обязательная трехкомпонентная система, включающая митохондриальную РНК-полимеразу, родственную бактериофагу Т7, фактор транскрипции, родственный рРНК-метилтрансферазе, h-mtTFB2, и фактор транскрипции/упаковки ДНК с высокой подвижностью. , h-mtTFA/TFAM. Используя достоверную рекомбинантную митохондриальную систему транскрипции человека из Escherichia coli, мы демонстрируем, что для специфической инициации промоторов мтДНК, LSP и HSP1, требуется только митохондриальная РНК-полимераза и h-mtTFB2 in vitro. Когда к этим базальным компонентам добавляется h-mtTFA, LSP демонстрирует гораздо более низкий порог активации и большую амплитуду ответа, чем HSP1. Кроме того, когда LSP и HSP1 вместе находятся на одной транскрипционной матрице, h-mtTFA-независимая транскрипция с HSP1 и h-mtTFA-зависимая транскрипция с обоих промоторов усиливается, и для стимуляции HSP1 требуется более высокая концентрация h-mtTFA. Эксперименты с конкуренцией промоторов показали, что в дополнение к компонентам транскрипции LSP, конкурирующим с HSP1, в эти аспекты регуляции промотора вовлечены дополнительные цис-действующие сигналы. Основываясь на этих результатах, мы предполагаем, что митохондриальная система транскрипции человека, возможно, эволюционировала, чтобы по-разному регулировать инициацию транскрипции и репликацию мтДНК, инициированную транскрипцией, в ответ на количество h-mtTFA, связанное с нуклеоидами, что может начать объяснять гетерогенность нуклеоидной структуры. и активность in vivo. Кроме того, это исследование проливает новый свет на эволюцию компонентов митохондриальной транскрипции, показывая, что человеческая система представляет собой регулируемую двухкомпонентную систему in vitro и, таким образом, более похожа на систему почкующихся дрожжей, чем считалось ранее.

Шат, ТЭ, Шадель, Г.С. Сборник механизмов экспрессии митохондриальных генов человека, связанных с болезнями. (2010) Экологический и молекулярный мутагенез. 51(5):360-79. DOI: 10.1002/em.20571

+ развернуть аннотацию

Митохондриальная ДНК млекопитающих кодирует 37 основных генов, необходимых для производства АТФ посредством окислительного фосфорилирования, нестабильность или неправильная регуляция которых связана с болезнями и старением человека. Помимо видов РНК, кодируемых мтДНК (13 мРНК, 12S и 16S рРНК и 22 тРНК), остальные факторы, необходимые для экспрессии митохондриальных генов (т. е. транскрипция, процессинг/модификация РНК и трансляция), включая специальный набор митохондриальных рибосомальные белки являются продуктами ядерных генов, которые импортируются в митохондриальный матрикс. Здесь мы описываем механизм экспрессии митохондриальных генов человека и при этом подчеркиваем специфические ассоциации этих регуляторных факторов с болезнями человека. Недавно в этой бурно развивающейся области были сделаны важные новые открытия, которые подготовили почву для будущих интересных исследований ключевого нерешенного вопроса о том, как экспрессия митохондриальных генов регулируется по-разному in vivo. Это должно способствовать лучшему пониманию того, почему мутации и дисфункция мтДНК вызывают сложную и тканеспецифическую патологию, характерную для митохондриальных болезненных состояний, и как митохондриальная дисфункция способствует более распространенной патологии человека и старению.

2009

Павар В., Цзинцзин Л., Патель Н., Каур Н., Доетч П.В., Шадель, Г.С., Чжан, Х., Сиде, В. Фосфорилирование контрольной точки киназы в ответ на эндогенное окислительное повреждение ДНК в стационарной фазе Saccharomyces cerevisiae с дефицитом репарации. (2009) Мех. Старение Dev. 130(8):501-8. DOI: 10.1016/j.mad.2009.06.002

+ развернуть аннотацию

Saccharomyces cerevisiae в стационарной фазе могут служить моделью постмитотических клеток высших эукариот. Фосфорилирование и активация киназы контрольной точки Rad53 наблюдались после более чем 2 дней культивирования, если два основных пути восстановления окислительного повреждения ДНК, репарация эксцизией оснований (BER) и репарация эксцизией нуклеотидов (NER), неактивны. Дикий тип показал низкую степень фосфорилирования Rad53 при резком увеличении периода инкубации. У бернерского штамма фосфорилирование Rad53 может быть устранено включением антиоксидантов или исключением кислорода. Кроме того, эта модификация и усиленный мутагенез в расширенной стационарной фазе отсутствовали у штаммов rho Degrees, не имеющих обнаруживаемой митохондриальной ДНК. Поэтому считается, что этот ответ контрольной точки зависит от активных форм кислорода, возникающих в результате митохондриального дыхания. Не было никаких доказательств прогрессирующего общего укорочения теломер во время инкубации в стационарной фазе. Поскольку Rad50 (из комплекса MRN) и Mec1 (гомолог ATR) были абсолютно необходимы для наблюдаемого ответа контрольной точки, мы предполагаем, что резецированные случайные двухцепочечные разрывы являются критическим повреждением. Одноцепочечная резекция может быть ускорена нерепарированным окислительным повреждением основания вблизи двухцепочечного разрыва.

Шадель, Г.С., Пан, Ю. Многогранная регуляция митохондрий с помощью TOR. (2009) Клеточный цикл. 8(14):2143. DOI: 10.4161/cc.8.14.9117

Котни Дж., Маккей С.Э., Шадель, Г.С. Выяснение отдельных, но совместных функций митохондриальных факторов транскрипции человека B1 и B2, связанных с рРНК-метилтрансферазой, в митохондриальном биогенезе открывает новое понимание мате (2009) Молекулярная генетика человека. 18(14):2670-82. DOI: 10.1093/hmg/ddp208

+ развернуть аннотацию

Митохондриальный биогенез контролируется сигнальными сетями, которые передают информацию в органеллы и обратно. Однако ключевые митохондриальные факторы, которые опосредуют такие пути, и то, как они способствуют заболеванию человека, до конца не изучены. Здесь мы демонстрируем, что митохондриальные факторы транскрипции человека B1 и B2, связанные с rRNA methyltransferase, являются ключевыми нижестоящими эффекторами митохондриального биогенеза, которые выполняют уникальные, но кооперативные функции. Основной функцией h-mtTFB2 является транскрипция и поддержание мтДНК, которое не зависит от активности его рРНК-метилтрансферазы, в то время как функция h-mtTFB1 представляет собой метилирование митохондриальной 12S рРНК, необходимое для нормальной митохондриальной трансляции, метаболизма и роста клеток. Сверхэкспрессия h-mtTFB1 вызывает гиперметилирование 12S рРНК, аномальный митохондриальный биогенез и повышенную гибель клеток, индуцированную сорбитолом. Эти фенотипы воспроизводятся в клетках, несущих патогенную мутацию мтДНК A1555G, что указывает на вредный ретроградный сигнал, зависимый от метилирования рРНК, в патологии глухоты, наследуемой по материнской линии, и теряет существенное понимание того, как h-mtTFB1 действует как ядерный модификатор этого заболевания.

Гриффитс, Л.М., Дудикан, Н.А., Шадель, Г.С., Дотч, П.В. Окислительное повреждение и мутагенез митохондриальной ДНК у Saccharomyces cerevisiae. (2009) Методы молекулярной биологии. 554:267-86. DOI: 10.1007/978-1-59745-521-3_17

+ развернуть аннотацию

Мутация митохондриальной ДНК человека (мтДНК) была связана с унаследованными от матери нервно-мышечными расстройствами и связана с более распространенными заболеваниями, такими как рак, диабет и болезнь Паркинсона. Мутации в мтДНК также накапливаются с возрастом и, следовательно, считается, что они способствуют старению и возрастной патологии. Размещенная в митохондриальном матриксе, мтДНК кодирует несколько белков, участвующих в производстве АТФ в процессе окислительного фосфорилирования, которое включает поток высокоэнергетических электронов через электрон-транспортную цепь (ЭТЦ). Из-за своей близости к ETC мтДНК очень уязвима для окислительного повреждения, опосредованного активными формами кислорода (АФК), такими как перекись водорода, супероксид и гидроксильные радикалы, которые постоянно продуцируются этой системой. Поэтому важно иметь возможность измерять окислительное повреждение мтДНК в нормальных физиологических условиях и во время стресса, связанного с окружающей средой или заболеванием. Почкующиеся дрожжи, Saccharomyces cerevisiae, представляют собой простую и информативную модельную систему для изучения таких окислительных повреждений мтДНК, потому что это одноклеточные эукариотические факультативные анаэробы, жизнеспособность которых условно зависит от митохондриального окислительного фосфорилирования. Здесь мы описываем методы количественной оценки окислительного повреждения мтДНК и мутагенеза в S. cerevisiae, некоторые из которых могут быть применены для разработки аналогичных анализов в клетках и тканях млекопитающих. Эти методы включают измерение количества точечных мутаций, которые происходят в мтДНК, с помощью анализа устойчивости к эритромицину, количественную оценку степени окислительного повреждения ДНК с использованием модифицированного Саузерн-блоттинга и измерение целостности мтДНК с помощью анализа «петитной индукции».

Краузер, Э.Д., Шао, Г., Джулиан, М.В., Макре, Дж.Э., Шадель, Г.С., Тридандапани, С., Хуанг, К., Веверс, доктор медицины Активации моноцитов некротическими клетками способствуют митохондриальные белки и рецепторы формилпептидов. (2009) Реанимационная медицина. 37(6):2000-9. DOI: 10.1097/CCM.0b013e3181a001ae

+ развернуть аннотацию

Suissa, S., Wang, Z., Poole, J., Wittkopp, S., Feder, J., Shutt, TE, Wallace, DC, Шадель, Г.С., Мишмар, Д. Древние генетические варианты мтДНК модулируют транскрипцию и репликацию мтДНК. (2009) ПЛОС Генетика. 5(5):e1000474. DOI: 10.1371/journal.pgen.1000474

+ развернуть аннотацию

Хотя функциональные последствия генетического фона митохондриальной ДНК (мтДНК) (гаплотипы, гаплогруппы) были продемонстрированы как исследованиями ассоциации заболеваний, так и экспериментами с клеточными культурами, неясно, какие из мутаций внутри гаплогруппы несут функциональные последствия, а какие «эволюционно молчат». автостопщики». Мы приступили к изучению функциональности мутаций, определяющих гаплогруппу, в регуляторной области транскрипции/репликации мтДНК с помощью транскрипции in vitro, предполагая, что мутации, определяющие гаплогруппу, происходящие в регуляторных мотивах мтДНК, могут влиять на эти процессы. Таким образом, мы провели скрининг >2500 полных мтДНК человека, представляющих все основные популяции по всему миру, на наличие естественных вариаций в экспериментально установленных сайтах связывания белков и регуляторных областях, включающих в общей сложности 241 п.н. в каждой мтДНК. Наш скрининг выявил 77/241 сайт, показывающий точечные мутации, которые можно разделить на нефиксированные (57/77, 74%) и изменения, определяющие гаплогруппу/подгаплогруппу (т. е. фиксированные изменения популяции, 20/77, 26%). Вариант, определяющий кавказскую гаплогруппу J (C295T), увеличивал связывание TFAM (анализ изменения электромобильности) и способность транскрипции L-цепи in vitro, особенно более короткого транскрипта, который картируется непосредственно перед блоком консервативной последовательности 1 (CSB1), a участок, связанный с РНК-праймированием репликации мтДНК. В соответствии с этим выводом, цибриды (т. е. клетки, имеющие один и тот же ядерный генетический фон, но различающиеся по фону мтДНК), несущие мтДНК гаплогруппы J, имели более чем двукратное увеличение числа копий мтДНК по сравнению с цибридами, содержащими гаплогруппу H, без явных различий. в устойчивых уровнях транскриптов, кодируемых мтДНК. Следовательно, мутация регуляторной области гаплогруппы J влияет на репликацию или стабильность мтДНК, что может частично объяснять фенотипическое влияние этой гаплогруппы. Таким образом, наш анализ впервые демонстрирует функциональное влияние конкретных мутаций контрольной области, определяющих гаплогруппу мтДНК, прокладывая путь к оценке функциональности как фиксированных, так и нефиксированных генетических вариантов в митохондриальном геноме.

Лебедева М.А., Итон Дж.С., Шадель, Г.С. Потеря p53 вызывает истощение митохондриальной ДНК и изменение митохондриального гомеостаза активных форм кислорода. (2009) Биохимика и биофизика Acta. 1787 (5): 328-34. DOI: 10.1016/j.bbabio.2009.01.004

+ развернуть аннотацию

В дополнение к своей центральной роли в передаче сигналов клеточного стресса, опухолевой супрессор p53 модулирует митохондриальное дыхание посредством активности ядерного фактора транскрипции и локализуется в митохондриях, где он усиливает апоптоз и подавляет мутагенез митохондриальной ДНК (мтДНК). Здесь мы демонстрируем новую консервативную роль p53 в поддержании количества копий мтДНК и гомеостазе митохондриальных активных форм кислорода (АФК). У млекопитающих мтДНК присутствует в количестве тысяч копий на клетку и необходима для нормального развития и функционирования клеток. Мы показываем, что первичные фибробласты мыши с нулевым p53 и первичные фибробласты человека с нокдауном p53 демонстрируют истощение мтДНК и снижение митохондриальной массы при нормальных условиях роста культуры. Это сопровождается редукцией субъединицы p53R2 мРНК и белка рибонуклеотидредуктазы и митохондриального транскрипционного фактора А (mtTFA) только на уровне белка. Наконец, p53-истощенные клетки обнаруживают значительное нарушение клеточного гомеостаза АФК, характеризующееся снижением уровней митохондриального и клеточного супероксида и повышением клеточного пероксида водорода. В целом, эти результаты объясняют дополнительные связанные с митохондриями функции p53 и указывают на истощение мтДНК и изменения АФК как потенциально важные для клеточной трансформации, фенотипов раковых клеток и эффекта Варбурга.

Раймундо, Н., Шадель, Г.С. «Радикальный» митохондриальный взгляд на патологию, связанную с аутофагией. (2009) Старение. 1(4):354-6. DOI: 10.18632/aging.100037

Таль, М.С., Сасаи, М., Ли, Х.К., Йорди, Б., Шадель, Г.С., Ивасаки, А. Отсутствие аутофагии приводит к зависимому от активных форм кислорода усилению передачи сигналов RLR. (2009) Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 106(8):2770-5. DOI: 10.1073/pnas.0807694106

+ развернуть аннотацию

Аутофагия — высококонсервативный процесс, который поддерживает гомеостаз за счет удаления поврежденных органелл и долгоживущих белков. Последствия дефицита аутофагии проявляются в различных патологических состояниях, включая нейродегенеративные заболевания, воспалительные заболевания и рак. Здесь мы изучали роль аутофагии в гомеостатической регуляции врожденной противовирусной защиты. Одноцепочечные РНК-вирусы распознаются членами RIG-I-подобных рецепторов (RLR) в цитозоле. RLR передают сигнал через IPS-1, что приводит к продукции ключевых противовирусных цитокинов, IFN I типа. Дефектные по аутофагии клетки Atg5(-/-) демонстрировали усиленную передачу сигналов RLR, повышенную секрецию IFN и устойчивость к заражению вирусом везикулярного стоматита. В отсутствие аутофагии в клетках накапливались дисфункциональные митохондрии, а также митохондриально-ассоциированные IPS-1. Активные формы кислорода (АФК), связанные с дисфункциональными митохондриями, были в значительной степени ответственны за усиленную передачу сигналов RLR в клетках Atg5 (-/-), поскольку антиоксидантная обработка блокировала избыточную передачу сигналов RLR. Кроме того, независимого от аутофагии увеличения митохондриальных АФК при обработке клеток ротеноном было достаточно для усиления передачи сигналов RLR в клетках дикого типа. Эти данные указывают на то, что аутофагия способствует гомеостатической регуляции врожденной противовирусной защиты посредством клиренса дисфункциональных митохондрий, и показали, что АФК, связанные с митохондриями, играют ключевую роль в усилении передачи сигналов RLR.

Пан, Ю., Шадель, Г.С. Увеличение хронологической продолжительности жизни за счет снижения передачи сигналов TOR требует подавления Sch9p и включает увеличение плотности митохондриального комплекса OXPHOS. (2009) Старение. 1(1):131-45. DOI: 10.18632/aging.100016

+ развернуть аннотацию

Чувствительная к питательным веществам мишень пути рапамицина (TOR), по-видимому, играет законсервированную роль в регулировании продолжительности жизни. Эта сигнальная сеть сложна, со многими нижестоящими физиологическими выходами, и, таким образом, механизмы, лежащие в основе ее возрастных эффектов, полностью не выяснены. Ранее мы продемонстрировали, что сниженная передача сигналов TOR (штаммы intor1Delta) продлевает хронологическую продолжительность жизни дрожжей (CLS) за счет увеличения потребления кислорода митохондриями, частично за счет повышающей регуляции трансляции субъединиц окислительного фосфорилирования, кодируемых мтДНК (OXPHOS). Здесь мы более подробно рассмотрели, как передача сигналов TOR влияет на функцию митохондрий и CLS, а также роль киназы Sch9p в пути TOR-митохондрии. Как и в случае с потреблением кислорода, митохондриальная трансляция повышена у штаммов tor1Delta только во время активного роста и ранней стационарной фазы роста. Это сопровождается соответствующим увеличением количества субъединиц OXPHOS, кодируемых как мтДНК, так и кодируемых ядром, на массу митохондрий. Однако эта повышенная плотность комплекса OXPHOS не связана с большим количеством митохондрий/клеток или клеточного АТФ и приводит к общему снижению мембранного потенциала, что свидетельствует о том, что передача сигналов TOR может влиять на разобщение дыхания. Наконец, мы документально подтверждаем, что киназа Sch9p является ключевым нижестоящим эффектором OXPHOS, ROS и CLS в пути TOR-митохондрии. В целом, наши результаты демонстрируют, что передача сигналов TOR играет глобальную роль в регуляции динамики и функции митохондриального протеома, что важно для его роли в старении, и предоставляют убедительные доказательства участия эффекта «митохондриального предварительного кондиционирования» в определении CLS.

2008

Шадель, Г.С. На дикую границу митохондриальных болезней и старения. (2008) Методы. 46(4):239-40. DOI: 10.1016/j.ymeth.2008.10.027

Бонавиц, Н.Д., Шатене-Лапуант, М., Верн, К.М., Шадель, Г.С. Экспрессия митохондриального белка Tar1p, кодируемого рДНК, строго контролируется и по-разному реагирует на митохондриальные респираторные потребности и дисфункцию. (2008) Текущая генетика. 54(2):83-94. DOI: 10.1007/s00294-008-0203-0

+ развернуть аннотацию

Новый дрожжевой белок Tar1p кодируется на антисмысловой цепи многокопийного ядерного гена 25S рРНК, локализуется в митохондриях и частично подавляет мутантную митохондриальную РНК-полимеразу, rpo41-R129D. Однако функция Tar1p в митохондриях и то, как регулируется его экспрессия, в настоящее время неизвестны. Здесь мы сообщаем, что Tar1p подвергается репрессии глюкозы и активируется во время пост-диауксического сдвига в среде с глюкозой и в среде с глицерином, в условиях, требующих повышенного митохондриального дыхания. Однако экспрессия Tar1p подавляется в ответ на митохондриальную дисфункцию, вызванную мутацией rpo41-R129D, или у штаммов, лишенных дыхания. Кроме того, в отличие от ранее сообщавшихся полезных эффектов умеренной сверхэкспрессии Tar1p в штамме rpo41-R129D, более высокий уровень сверхэкспрессии усугубляет производные от АФК фенотипы этого мутанта, включая снижение дыхания и продолжительности жизни. Наконец, двухгибридный скрининг и исследования связывания in vitro выявили физическое взаимодействие между Tar1p и Coq5p, ферментом, участвующим в синтезе митохондриального переносчика электронов и антиоксиданта, кофермента Q. Мы предполагаем, что экспрессия Tar1p индуцируется в респираторных условиях для поддержания окислительного фосфорилирования. емкость, но его уровни в митохондриях обычно низки и строго контролируются. Кроме того, мы предполагаем, что Tar1p подавляется, когда дыхание нарушено, чтобы предотвратить вредные ROS-зависимые последствия митохондриальной дисфункции.

Шадель, Г.С. Экспрессия и поддержание митохондриальной ДНК: новый взгляд на патологию заболеваний человека. (2008) Являюсь. J. Pathol. 172(6):1445-56. DOI: 10.2353/ajpath.2008.071163

+ развернуть аннотацию

Митохондрии являются центральными участниками клеточного энергетического метаболизма, и, следовательно, дефекты их функции приводят ко многим характерным метаболическим заболеваниям. Критической для их функции является митохондриальная ДНК (мтДНК), которая кодирует субъединицы комплексов окислительного фосфорилирования, необходимых для клеточного дыхания и продукции АТФ. Для экспрессии, репликации и поддержания мтДНК необходимы факторы, кодируемые ядерными генами. Они включают не только вовлеченные первичные механизмы (например, компоненты транскрипции и репликации), но также и механизмы в сигнальных путях, которые опосредуют или воспринимают изменения в митохондриальной функции в соответствии с изменяющимися клеточными потребностями или условиями окружающей среды. Мутации в них вносят свой вклад в патологию заболеваний человека благодаря механизмам, которые обнаруживаются с беспрецедентной скоростью. Как я буду обсуждать здесь, основной белковый механизм, необходимый для инициации транскрипции в митохондриях человека, был выяснен после открытия двух многофункциональных митохондриальных факторов транскрипции, h-mtTFB1 и h-mtTFB2, которые также являются рРНК-метилтрансферазами. Кроме того, недавно было обнаружено участие сигнальных путей мутации атаксии-телеангиэктазии (АТМ) и мишени рапамицина (TOR) в регуляции митохондриального гомеостаза и экспрессии генов. Эти достижения отражают текущий ландшафт исследований митохондрий, который можно охарактеризовать как взрывной благодаря открытиям ранее непредвиденной роли митохондрий в заболеваниях и старении человека.

Шлейхер, М., Шеперд, Б.Р., Суарес, Ю., Фернандес-Эрнандо, К., Ю, Дж., Пан, Ю., Асеведо, Л.М., Шадель, Г.С., Сесса, туалет Прогибитин-1 поддерживает ангиогенную способность эндотелиальных клеток, регулируя митохондриальную функцию и старение. (2008) Журнал клеточной биологии. 180(1):101-12. DOI: 10.1083/jcb.200706072

+ развернуть аннотацию

Прогибитин 1 (PHB1) является высококонсервативным белком, который в основном локализуется на внутренней митохондриальной мембране и участвует в регуляции митохондриальной функции у дрожжей. Поскольку митохондрии становятся важным регулятором сосудистого гомеостаза, мы исследовали функцию PHB1 в эндотелиальных клетках. PHB1 сильно экспрессируется в сосудистой системе, и нокдаун PHB1 в эндотелиальных клетках увеличивает митохондриальную продукцию активных форм кислорода посредством ингибирования комплекса I, что приводит к клеточному старению. Как прямое следствие, и Akt, и Rac1 гиперактивируются, что приводит к перестройкам цитоскелета и снижению подвижности эндотелиальных клеток, т.е. миграции и образованию трубочек. Это также отражено в анализе ангиогенеза in vivo, где подавление PHB1 блокирует образование функциональных кровеносных сосудов. В совокупности наши результаты свидетельствуют о том, что PHB1 важен для митохондриальной функции и предотвращает старение, вызванное активными формами кислорода, и тем самым поддерживает ангиогенную способность эндотелиальных клеток.

2007

Eaton, JS, Lin, ZP, Sartorelli, AC, Bonawitz, ND, Шадель, Г.С. Киназа с мутацией атаксии-телеангиэктазии регулирует рибонуклеотидредуктазу и митохондриальный гомеостаз. (2007) Журнал клинических исследований. 117(9):2723-34. DOI: 10.1172/JCI31604

+ развернуть аннотацию

Киназа с мутацией атаксии-телеангиэктазии (АТМ) управляет реакциями на повреждение ядерной ДНК, но предполагается, что она участвует в других важных и клинически значимых функциях. Здесь мы приводим доказательства того, что мы считаем двумя новыми и взаимосвязанными ролями ATM: регуляция рибонуклеотидредуктазы (RR), фермента, ограничивающего скорость синтеза de novo дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, и контроль митохондриального гомеостаза. Фибробласты больных атаксией-телеангиэктазией (AT), фибробласты дикого типа, обработанные ингибитором ATM KU-2, и клетки, в которых RR ингибируется фармакологически или с помощью РНК-интерференции (RNAi), приводят к истощению митохондриальной ДНК (мтДНК) в нормальных условиях роста. . Нарушение передачи сигналов ATM в первичных фибробластах AT также приводит к глобальному нарушению регуляции субъединиц R55933, R1 и p2R53 RR, отмене RR-зависимой активации мтДНК в ответ на ионизирующее излучение, высокому соотношению митохондриальный фактор транскрипции A (mtTFA)/мтДНК и повышенная устойчивость к ингибиторам митохондриального дыхания и трансляции. Наконец, наблюдается сниженная экспрессия субъединицы R2 RR и тканеспецифические изменения количества копий мтДНК в тканях мышей с нулевым ATM, причем последние повторно воспроизводятся в тканях пациентов с АТ человека. Основываясь на этих результатах, мы предполагаем, что нарушение RR и митохондриального гомеостаза способствует сложной патологии AT и что гены RR являются локусами-кандидатами в синдромах истощения мтДНК.

Лебедева М.А., Шадель, Г.С. Изменения количества копий мтДНК, вызванные клеточным циклом и рибонуклеотидредуктазой, влияют на наследование мтДНК без ущерба для экспрессии митохондриальных генов. (2007) Клеточный цикл. 6(16):2048-57. DOI: 10.4161/cc.6.16.4572

+ развернуть аннотацию

Большинство эукариот поддерживают несколько копий мтДНК, от 20-50 у дрожжей до 10,000 в клетках млекопитающих. Митохондриальный геном кодирует основные субъединицы дыхательной цепи, но количество молекул мтДНК, по-видимому, превышает количество, необходимое для поддержания адекватного дыхания, о чем свидетельствует «пороговый эффект» при митохондриальных заболеваниях. Таким образом, другие давления отбора, по-видимому, способствовали универсальному поддержанию множественных молекул мтДНК/клетку. Здесь мы проанализировали взаимодействие между двумя путями, предложенными для регуляции числа копий мтДНК у Saccharomyces cerevisiae, и требованием нормального числа копий мтДНК для экспрессии митохондриальных генов, дыхания и наследования. Мы предоставляем первое прямое доказательство того, что активация мтДНК может быть достигнута за счет увеличения активности рибонуклеотидредуктазы (RNR) за счет дерепрессии транскрипции ядерного гена RNR или устранения регуляции аллостерической обратной связи. Анализ мутантных штаммов rad53 также выявил повышенную регуляцию количества копий мтДНК независимо от повышения активности RNR. Мы представляем доказательства того, что длительный клеточный цикл позволяет накапливать мтДНК у этих штаммов. Анализ нескольких штаммов с повышенным или пониженным уровнем мтДНК показал, что существуют механизмы, предотвращающие значительные изменения в экспрессии митохондриальных генов и дыхании перед лицом примерно двукратных изменений числа копий мтДНК. Однако истощение мтДНК у нулевых по abf2 штаммов приводит к дефектному наследованию мтДНК, которое частично восстанавливается за счет пополнения мтДНК за счет сверхэкспрессии RNR1. Эти результаты показывают, что одной из ролей множественных копий мтДНК является обеспечение оптимального наследования мтДНК во время клеточного деления.

Бонавиц, Северная Дакота, Шадель, Г.С. Переосмысление митохондриальной теории старения: роль экспрессии митохондриальных генов в определении продолжительности жизни. (2007) Клеточный цикл. 6(13):1574-8. DOI: 10.4161/cc.6.13.4457

+ развернуть аннотацию

Котни Дж., Ван З., Шадель, Г.С. Относительное количество митохондриальной системы транскрипции человека и различные роли h-mtTFB1 и h-mtTFB2 в митохондриальном биогенезе и экспрессии генов. (2007) Исследования нуклеиновых кислот. 35(12):4042-54. DOI: 10.1093/нар/gkm424

+ развернуть аннотацию

Для митохондриальной транскрипции человека требуется родственная бактериофагу РНК-полимераза, POLRMT, белок, связывающий мтДНК, h-mtTFA/TFAM, и два транскрипционных фактора/рРНК-метилтрансферазы, h-mtTFB1 и h-mtTFB2. Здесь мы определили устойчивые уровни этих основных компонентов транскрипции и изучили последствия целенаправленного повышения уровня h-mtTFB1 или h-mtTFB2 в клетках HeLa. В расчете на молекулу мы обнаруживаем примерно 6-кратный избыток POLRMT по отношению к мтДНК и примерно 3-кратный избыток h-mtTFB2, чем h-mtTFB1. Мы также оцениваем h-mtTFA примерно в 50 молекул/мтДНК, отношение, которое, по прогнозам, поддерживает надежную транскрипцию, но не покрывает мтДНК. В соответствии с ролью h-mtTFB2 в транскрипции и транскрипционно-праймированной репликации увеличение количества митохондриальной ДНК и транскриптов является результатом его сверхэкспрессии. Это сопровождается повышенной скоростью трансляции большинства, но не всех белков, кодируемых мтДНК. Сверхэкспрессия h-mtTFB1 существенно не влияла на эти параметры, но приводила к усилению митохондриального биогенеза. Кроме того, уровень мРНК и белка h-mtTFB1 повышается в ответ на избыточную экспрессию h-mtTFB2, что указывает на существование ретроградного сигнала к ядру для скоординированной регуляции экспрессии этих родственных факторов. В целом, наши результаты обеспечивают основу для понимания регуляции митохондриальной транскрипции человека in vivo и определяют различные роли h-mtTFB1 и h-mtTFB2 в митохондриальном биогенезе и экспрессии генов, которые вместе, вероятно, точно настраивают митохондриальную функцию.

Бонавиц, Н.Д., Шатене-Лапуант, М., Пан, Ю., Шадель, Г.С. Снижение передачи сигналов TOR увеличивает хронологическую продолжительность жизни за счет увеличения дыхания и повышения экспрессии митохондриальных генов. (2007) Метаболизм клеток. 5(4):265-77. DOI: 10.1016/j.cmet.2007.02.009

+ развернуть аннотацию

Отношения между митохондриальным дыханием, активными формами кислорода (АФК) и продолжительностью жизни сложны и остаются спорными. Ингибирование мишени сигнального пути рапамицина (TOR) увеличивает продолжительность жизни у некоторых модельных организмов. Здесь мы показываем, что делеция гена TOR1 продлевает хронологическую продолжительность жизни Saccharomyces cerevisiae, прежде всего, за счет увеличения митохондриального дыхания посредством усиленной трансляции субъединиц комплекса окислительного фосфорилирования, кодируемых мтДНК. В отличие от ранее описанных путей, регулирующих хронологическую продолжительность жизни, мы показываем, что делеция TOR1 задерживает старение независимо от антиоксидантного гена SOD2. Кроме того, штаммы дикого типа и нулевые по tor1 штаммы различаются по продолжительности жизни только в том случае, если они способны к дыханию и выращены в условиях нормоксии в присутствии глюкозы. Мы предполагаем, что ингибирование передачи сигналов TOR вызывает дерепрессию дыхания во время роста в глюкозе и что последующее увеличение потребления кислорода митохондриями ограничивает внутриклеточный кислород и АФК-опосредованные повреждения во время гликолитического роста, что приводит к снижению клеточных АФК и увеличению хронологической продолжительности жизни.

Ван З., Котни Дж., Шадель, Г.С. Митохондриальный рибосомный белок человека MRPL12 напрямую взаимодействует с митохондриальной РНК-полимеразой, модулируя экспрессию митохондриальных генов. (2007) Журнал биологической химии. 282(17):12610-8. DOI: 10.1074/jbc.M700461200

+ развернуть аннотацию

Основной механизм митохондриальной транскрипции человека включает РНК-полимеразу, родственную с бактериофагом, с одной субъединицей, POLRMT, высокоподвижный ДНК-связывающий белок h-mtTFA/TFAM и два белка-коактиватора транскрипции, h-mtTFB1 и h-mtTFB2, которые также обладают рРНК-метилтрансферазной активностью. Повторение специфической инициации транскрипции in vitro может быть достигнуто с помощью комплекса POL-RMT, h-mtTFA и либо h-mtTFB1, либо h-mtTFB2. Однако природа митохондриальных транскрипционных комплексов in vivo и потенциальное участие дополнительных белков в процессе транскрипции в митохондриях человека подробно не исследовались. У Saccharomyces cerevisiae транскрипция и трансляция физически связаны посредством образования многобелкового комплекса, зародышеобразующего за счет связывания Nam1p с амино-концевым доменом мтРНК-полимеразы (Rpo41p). Эта парадигма модельной системы привела нас к поиску белков, которые взаимодействуют с POLRMT, чтобы регулировать экспрессию митохондриальных генов у людей. Используя стратегию аффинного захвата для идентификации POL-RMT-связывающих белков, мы идентифицировали митохондриальный рибосомный белок L7/L12 (MRPL12) как белок в митохондриальных экстрактах HeLa, который специфически взаимодействует с POLRMT in vitro. Очищенный рекомбинантный MRPL12 связывается с POLRMT и стимулирует активность митохондриальной транскрипции in vitro, демонстрируя, что это взаимодействие является как прямым, так и функциональным. Наконец, в клетках HeLa, которые сверхэкспрессируют MRPL12, меченный эпитопом FLAG, наблюдаются повышенные устойчивые уровни транскриптов, кодируемых мтДНК, и комплексы MRPL12-POLRMT могут подвергаться совместной иммунопреципитации, что дает убедительные доказательства того, что это взаимодействие усиливает митохондриальную транскрипцию или стабильность РНК in vivo. . Мы предполагаем, что взаимодействие MRPL12 с POLRMT, вероятно, является частью нового регуляторного механизма, который координирует митохондриальную транскрипцию с трансляцией и/или биогенезом рибосом во время экспрессии митохондриальных генов человека.

Чжан Х., Луо Ю., Чжан В., Хе Ю., Дай С., Чжан Р., Хуанг Ю., Бернатчес П., Джордано Ф.Дж., Шадель, Г., Сесса, WC, Мин, Вт. Эндотелиально-специфическая экспрессия митохондриального тиоредоксина улучшает функцию эндотелиальных клеток и уменьшает атеросклеротические поражения. (2007) Являюсь. J. Pathol. 170(3):1108-20. DOI: 10.2353/ajpath.2007.060960

+ развернуть аннотацию

Функция митохондриальной антиоксидантной системы тиоредоксина (Trx2) в сосудистой сети не изучена. Используя специфичный для эндотелиальных клеток (EC) трансгенез митохондриальной формы гена тиоредоксина у мышей (Trx2 TG), мы показываем критическую роль Trx2 в регуляции функций эндотелия. У мышей Trx2 TG было повышено общее количество антиоксидантов, снижен окислительный стресс и повышен уровень оксида азота (NO) в сыворотке по сравнению с их контрольными однопометниками. Соответственно, аорты от мышей Trx2 TG демонстрируют уменьшенную вазоконстрикцию и усиленную вазодилатацию. Используя ЭК, выделенные от мышей Trx2 TG, мы также показываем, что Trx2 увеличивает способность ЭК удалять активные формы кислорода, образующиеся из митохондрий, что приводит к увеличению биодоступности NO в ЭК. Что еще более важно, Trx2 улучшает функцию EC и уменьшает атеросклеротические поражения в модели мышей с дефицитом аполипопротеина E. Наши данные являются первым свидетельством того, что Trx2 играет критическую роль в сохранении функции ЭК сосудов и предотвращении развития атеросклероза, частично за счет снижения окислительного стресса и увеличения биодоступности NO.

Лин, З.П., Белкорт, М.Ф., Карбон, Р., Итон, Дж.С., Пенкет, П.Г., Шадель, Г.С., Кори, JG, Сарторелли, AC Избыток субъединиц рибонуклеотидредуктазы R2 координирует контрольную точку S-фазы, чтобы облегчить восстановление повреждений ДНК и восстановление после репликационного стресса. (2007) Biochem. Pharmacol. 73(6):760-72. DOI: 10.1016/j.bcp.2006.11.014

+ развернуть аннотацию

Рибонуклеотидредуктаза (RNR), которая состоит из субъединиц R1 и R2, катализирует ключевой этап синтеза дезоксирибонуклеозидтрифосфата (dNTP) для репликации и восстановления ДНК. Субъединица R2 контролируется специфичным для клеточного цикла образом для своевременного синтеза ДНК и отрицательно регулируется p53 в ответ на повреждение ДНК. Здесь мы демонстрируем, что присутствие избыточных субъединиц R2 в клетках рака толстой кишки человека p53 (-/-) HCT-116 защищает от повреждения ДНК и стресса репликации. Опосредованный миРНК стабильный нокдаун (>80%) избыточных субъединиц R2 не влияет на пролиферативный рост, но приводит к повышенному накоплению гамма-H2Ax и замедленному восстановлению после повреждений ДНК, вызванных воздействием цисплатина и триапина. Эта усиленная индукция гамма-H2Ax в клетках с нокдауном R2 объясняется сниженной способностью восстанавливать поврежденную ДНК и преодолевать блокировку репликации. Отсутствие избыточных субъединиц R2, следовательно, увеличивает активацию chk1 и деградацию cdc25A, вызывая затруднение прохождения клетки через S-фазу и усиление апоптоза в ответ на повреждение ДНК и стресс репликации. Напротив, уровень субъединиц R1, по-видимому, ограничивает, поскольку истощение субъединицы R1 напрямую активирует контрольную точку S-фазы из-за стресса репликации, связанного с нарушением активности RNR. Эти данные свидетельствуют о том, что избыток субъединиц R2 облегчает репарацию повреждений ДНК и восстановление после стресса репликации посредством координации с контрольной точкой S фазы в отсутствие функционального p53. Таким образом, уровень субъединицы R2 представляет собой важную детерминанту химиочувствительности раковых клеток и служит потенциальной мишенью для усиления терапии, основанной на повреждении ДНК.

Шат, ТЭ, Шадель, Г.С. Расширение митохондриального интерактома. (2007) Геном Биология. 8(2):203. DOI: 10.1186/gb-2007-8-2-203

+ развернуть аннотацию

2006

Бонавиц, Н.Д., Клейтон, Д.А., Шадель, Г.С. Инициация и не только: множественные функции митохондриальной транскрипционной машины человека. (2006) Молекулярная клетка. 24(6):813-25. DOI: 10.1016/j.molcel.2006.11.024

+ развернуть аннотацию

Котни, Дж., Шадель, Г.С. Доказательства раннего события дупликации гена в эволюции семейства митохондриальных факторов транскрипции B и поддержания активности рРНК-метилтрансферазы в mtTFB1 и mtTFB2 человека. (2006) Дж. Мол. Эвол. 63(5):707-17. DOI: 10.1007/s00239-006-0075-1

+ развернуть аннотацию

Большинство многоклеточных животных имеют два ядерных гена, кодирующих ортологи хорошо охарактеризованного митохондриального фактора транскрипции Saccharomyces cerevisiae B (sc-mtTFB). Этот класс транскрипционных факторов гомологичен бактериальному семейству KsgA рРНК-метилтрансфераз, которые в Escherichia coli диметилируют соседние адениновые остатки в стебле-петле 16S рРНК. Эта посттранскрипционная модификация сохраняется в большинстве цитоплазматических и митохондриальных рРНК многоклеточных животных. Митохондриальный фактор транскрипции B1 (h-mtTFB1) человека разумного обладает этой ферментативной активностью, предполагая, что он является белком с двойной функцией, участвующим в митохондриальной транскрипции и трансляции. Здесь мы демонстрируем, что h-mtTFB2 также обладает активностью метилтрансферазы рРНК, но является менее эффективным ферментом, чем h-mtTFB1. Напротив, sc-mtTFB не имеет обнаруживаемой активности рРНК-метилтрансферазы, что коррелирует с отсутствием соответствующей модификации в митохондриальной рРНК почкующихся дрожжей. Основываясь на этих результатах и сообщениях о том, что mtTFB1 и mtTFB2 Drosophila melanogaster не имеют полностью перекрывающихся функций, мы предлагаем модель регуляции мтДНК человека, которая учитывает h-mtTFB1 и h-mtTFB2, вероятно, имеющие частично избыточные функции транскрипционного фактора и рРНК метилтрансферазы. Наконец, филогенетический анализ этого семейства белков убедительно свидетельствует о том, что присутствие двух гомологов mtTFB у многоклеточных животных является результатом события дупликации генов, которое произошло на ранней стадии эукариотической эволюции до дивергенции грибов и многоклеточных животных. Эта модель предполагает, что после события дупликации гена возникло дифференциальное избирательное давление на активность rRNA methyltransferase и фактора транскрипции генов mtTFB, с крайними случаями, достигающими кульминации в потере одного из паралогичных генов у определенных видов.

Бонавиц, Н.Д., Родехеффер, М.С., Шадель, Г.С. Дефектная экспрессия митохондриального гена приводит к опосредованному активными формами кислорода ингибированию дыхания и сокращению продолжительности жизни дрожжей. (2006) Молекулярная и клеточная биология. 26(13):4818-29. DOI: 10.1128/MCB.02360-05

+ развернуть аннотацию

Митохондриальная дисфункция вызывает многочисленные заболевания человека и, как широко полагают, связана со старением. Однако механизмы, с помощью которых скомпрометированная экспрессия митохондриальных генов вызывает описанное разнообразие клеточных дефектов, остаются неясными. Аминоконцевой домен (ATD) дрожжевой митохондриальной РНК-полимеразы необходим для сопряжения транскрипции с трансляцией во время экспрессии субъединиц окислительного фосфорилирования, кодируемых митохондриальной ДНК. Здесь мы сообщаем, что несколько мутантов ATD демонстрируют уменьшенную хронологическую продолжительность жизни. Самый тяжелый из них (с мутацией rpo41-R129D) демонстрирует несбалансированную митохондриальную трансляцию, условную инактивацию дыхания, повышенную продукцию активных форм кислорода (АФК) и повышенный окислительный стресс. Снижение АФК за счет сверхэкспрессии супероксиддисмутазы (продукт SOD1 или SOD2) не только значительно увеличивает продолжительность жизни этого мутанта, но также увеличивает его способность дышать. Другой мутант ATD с аналогичным сниженным дыханием (rpo41-D152A/D154A) накапливает только промежуточные уровни АФК и имеет менее серьезный дефект продолжительности жизни, который не лечится SOD. В целом, наши результаты убедительно свидетельствуют о «порочном цикле» митохондриальной продукции АФК и позволяют предположить, что количество генерируемых АФК зависит от точной природы дефекта экспрессии митохондриального гена и инициирует нисходящую спираль окислительного стресса только в том случае, если критический порог перейден.

2005

О'Рурк, Т.В., Дудикан, Н.А., Чжан, Х., Итон, Дж.С., Доетч, П.В., Шадель, Г.С. Дифференциальное участие родственных ДНК-хеликаз Pif1p и Rrm3p в мутагенезе и стабильности мтДНК указывает. (2005) Ген. 354:86-92. DOI: 10.1016/j.gene.2005.03.031

+ развернуть аннотацию

За исключением эксцизионной репарации оснований, консервативные пути и механизмы, которые поддерживают стабильность митохондриального генома, остаются в значительной степени неопределенными. У почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae Pif1p представляет собой уникальную ДНК-хеликазу, локализованную как в ядре, так и в митохондриях, где она участвует в поддержании целостности ДНК. Ранее мы выяснили роль Pif1p в устойчивости к окислительному повреждению мтДНК, которая, по-видимому, отличается от его предполагаемой функции в рекомбинации мтДНК. Штаммы, лишенные Pif1p (pif1Delta), демонстрируют повышенную скорость образования petite-мутантов (индикатор нестабильности мтДНК) и повышенный точечный мутагенез мтДНК. Здесь мы показываем, что делеция гена RRM3, который кодирует геликазу ДНК, тесно связанную с Pif1p, значительно восстанавливает фенотип petite-induction штамма pif1Delta. Однако подавление этого фенотипа не сопровождалось соответствующим снижением точечного мутагенеза мтДНК. Вместо этого делеция только одного RRM3 приводила к увеличению точечного мутагенеза мтДНК, который был синергичен с таковым, вызванным мутацией pif1Delta. Кроме того, мы обнаружили, что сверхэкспрессия RNR1, кодирующего большую субъединицу рибонуклеотидредуктазы (RNR), восстанавливает фенотип petite-индукции мутации pif1Delta в той же степени, что и делеция RRM3. Это, в сочетании с нашим открытием, что протеинкиназа Rad53p фосфорилирована в двойном мутантном штамме rrm3Delta pif1Delta, приводит нас к выводу, что одним механизмом, посредством которого делеция RRM3 влияет на стабильность мтДНК, является модулирование пулов митохондриальных дезоксинуклеозидтрифосфатов. Мы предполагаем, что это достигается путем передачи сигналов через консервативный Mec1/Rad53, путь контрольной точки S-фазы, чтобы индуцировать экспрессию и активность RNR. В целом, наши результаты определяют новую роль Rrm3p в митохондриальной функции и указывают на то, что Pif1p и Rrm3p влияют на общий процесс (или процессы), участвующие в репликации, репарации или стабильности мтДНК.

Шадель, Г.С. Митохондриальная ДНК, аконитаза «обертывает» ее. (2005) Тенденции биохимических наук. 30(6):294-6. DOI: 10.1016/j.tibs.2005.04.007

+ развернуть аннотацию

Дудикан Н.А., Сонг Б., Шадель, Г.С., Дотч, П.В. Окислительное повреждение ДНК вызывает нестабильность митохондриального генома у Saccharomyces cerevisiae. (2005) Молекулярная и клеточная биология. 25(12):5196-204. DOI: 10.1128/MCB.25.12.5196-5204.2005

+ развернуть аннотацию

Митохондрии содержат собственный геном, целостность которого необходима для нормального клеточного энергетического обмена. Активные формы кислорода (АФК), образующиеся при нормальном митохондриальном дыхании, могут повреждать клеточные макромолекулы, включая митохондриальную ДНК (мтДНК), и вызывают дегенеративные заболевания, рак и старение. Мы разработали стратегии для повышения митохондриального окислительного стресса путем воздействия антимицина и H(2)O(2) или использования мутантов, лишенных митохондриальной супероксиддисмутазы (sod2Delta). Были проведены эксперименты со штаммами, нарушенными эксцизионной репарацией митохондриальных оснований (ntg1Delta) и устойчивостью к окислительному повреждению (pif1Delta), чтобы определить взаимосвязь между этими путями. Мы наблюдали усиление продукции АФК, что приводило к прямому увеличению окислительного повреждения мтДНК и мутагенеза. Мутанты с дефицитом репарации, подвергшиеся воздействию условий окислительного стресса, проявляли глубокую геномную нестабильность. Устранение Ntg1p и Pif1p приводило к синергетическому нарушению дыхательной способности при воздействии антимицина и H(2)O(2). Целостность митохондриального генома была существенно нарушена в штаммах ntg1Delta pif1Delta sod2Delta, поскольку эти клетки демонстрируют полную потерю мтДНК. Стабильный штамм с дефектом дыхания, обладающий нормальным набором путей устойчивости к повреждению мтДНК, демонстрировал полную потерю мтДНК при воздействии антимицина и H(2)O(2). Эту потерю можно было предотвратить сверхэкспрессией Sod2p. Эти результаты предоставляют прямые доказательства того, что окислительное повреждение мтДНК может быть основным фактором нестабильности митохондриального генома, и демонстрируют сотрудничество Ntg1p и Pif1p, чтобы противостоять внедрению повреждений в митохондриальный геном.

Тейлор, С.Д., Чжан, Х., Итон, Дж.С., Родехеффер, М.С., Лебедева, М.А., О'Рурк, Т.В., Сиде, В., Шадель, Г.С. Консервативный путь ядерной контрольной точки Mec1/Rad53 регулирует количество копий митохондриальной ДНК у Saccharomyces cerevisiae. (2005) Молекулярная биология клетки. 16(6):3010-8. DOI: 10.1091/mbc.e05-01-0053

+ развернуть аннотацию

Как количество копий митохондриальной ДНК (мтДНК) определяется и модулируется в соответствии с клеточными потребностями, в значительной степени неизвестно. Наши предыдущие исследования родственных ДНК-хеликаз Pif1p и Rrm3p выявили роль этих факторов и консервативного пути ядерных контрольных точек Mec1/Rad53 в мутагенезе и стабильности мтДНК в Saccharomyces cerevisiae. Здесь мы демонстрируем другую новую функцию этого пути в регуляции количества копий мтДНК. Делеция RRM3 или SML1 или сверхэкспрессия RNR1, которая повторяет активацию пути Mec1/Rad53, приводила к примерно двукратному увеличению содержания мтДНК по сравнению с соответствующими штаммами дрожжей дикого типа. Кроме того, делеция RRM3 или SML1 полностью устраняла примерно 50% истощение мтДНК, наблюдаемое в нулевом штамме pif1. Более того, было показано, что делеция SML1 является эпистатической как для нулевой мутации rad53, так и для нулевой мутации rrm3, помещая эти три гена в один и тот же генетический путь регуляции числа копий мтДНК. Наконец, увеличение количества копий мтДНК посредством пути Mec1/Rad53 может происходить независимо от Abf2p, мтДНК-связывающего белка, который, как и его многоклеточные гомологи, участвует в контроле количества копий мтДНК. Вместе эти результаты показывают, что передача сигналов через путь Mec1/Rad53 увеличивает количество копий мтДНК путем изменения пулов дезоксирибонуклеозидтрифосфатов посредством активности рибонуклеотидредуктазы. Это включает первую связь консервативного сигнального пути с регуляцией количества копий митохондриального генома и предполагает, что гомологичные пути у людей могут аналогичным образом регулировать содержание мтДНК в физиологических условиях.

2004

Шадель, Г.С. Связь митохондриального механизма транскрипции с болезнями человека. (2004) Тенденции в генетике. 20(10):513-9. DOI: 10.1016/j.tig.2004.08.005

+ развернуть аннотацию

Митохондрии являются центральными процессорными единицами клеточного энергетического метаболизма и, помимо осуществления окислительного фосфорилирования, регулируют такие важные процессы, как апоптоз и гомеостаз кальция. Поскольку митохондрии обладают геномом, который играет центральную роль в их множественных функциях, необходимо понимание механизма экспрессии митохондриальных генов, чтобы расшифровать многие способы, которыми митохондриальная дисфункция способствует развитию болезней человека. С этой целью недавно были охарактеризованы два фактора транскрипции человека, которые родственны рРНК метилтрансферазам, что обеспечивает новое понимание механизма митохондриальной транскрипции и новую связь с материнской наследственной глухотой. Кроме того, исследования модельной системы Saccharomyces cerevisiae выявили функциональное сочетание транскрипции и трансляции на внутренней митохондриальной мембране, где начинается сборка системы окислительного фосфорилирования. Дефекты аналогичного механизма сцепления у людей могут лежать в основе дефицита цитохромоксидазы, который вызывает форму синдрома Лея.

Шадель, Г.С. Митохондриальный фактор транскрипции с двойной функцией отключает глухоту. (2004) Молекулярная генетика и метаболизм. 82(1):1-3. DOI: 10.1016/j.ymgme.2004.02.003

2003

Маккаллох, В., Шадель, Г.С. Митохондриальный фактор транскрипции человека B1 взаимодействует с C-концевой областью активации h-mtTFA и стимулирует транскрипцию независимо от его РНК-метилтрансферазной активности. (2003) Молекулярная и клеточная биология. 23 (16): 5816-24.

+ развернуть аннотацию

Значительным достижением в понимании экспрессии митохондриальных генов является недавняя идентификация двух новых митохондриальных транскрипционных факторов человека, h-mtTFB1 и h-mtTFB2. Оба белка стимулируют транскрипцию в сотрудничестве с фактором транскрипции с высокой подвижностью групповой коробки, h-mtTFA, и гомологичны рРНК-метилтрансферазам. Фактически, двойная функциональная природа h-mtTFB1 недавно была продемонстрирована его способностью метилировать консервативный субстрат рРНК. Здесь мы демонстрируем, что h-mtTFB1 связывает h-mtTFA как в митохондриальных экстрактах клеток HeLa, так и в анализах прямого связывания посредством взаимодействия, для которого требуется C-концевой хвост h-mtTFA, область, необходимая для активации транскрипции. Кроме того, точечные мутации в консервативных мотивах метилтрансферазы h-mtTFB1 показали, что он стимулирует транскрипцию in vitro независимо от связывания S-аденозилметионина и активности рРНК-метилтрансферазы. Более того, одна мутация (G65A) устраняла способность h-mtTFB1 связываться с ДНК, но не влияла на активацию транскрипции. Эти результаты в сочетании с наблюдением, что h-mtTFB1 и полимераза митохондриальной РНК (h-mtRNA) человека также могут подвергаться коиммунопреципитации, позволяют нам предложить модель, в которой h-mtTFB разграничивает расположение митохондриальных промоторов и где белки h-mtTFB связывают взаимодействие между C-концевым хвостом h-mtTFA и мтРНК-полимеразой для облегчения специфической инициации транскрипции. В целом, эти данные обеспечивают важное новое понимание механизма инициации транскрипции в митохондриях человека и указывают на то, что двойные функции h-mtTFB1 могут быть разделены.

Родехеффер, MS, Шадель, Г.С. Множественные взаимодействия с участием амино-концевого домена дрожжевой мтРНК-полимеразы определяют эффективность синтеза митохондриального белка. (2003) Журнал биологической химии. 278(20):18695-701. DOI: 10.1074/jbc.M301399200

+ развернуть аннотацию

Было показано, что амино-концевой домен (ATD) митохондриальной РНК-полимеразы Saccharomyces cerevisiae обеспечивает функциональную связь между транскрипцией и посттранскрипционными событиями во время экспрессии митохондриального гена. Эта связь в значительной степени опосредована ее взаимодействиями с белком матрикса Nam1p и, на основании генетических фенотипов, с белком митохондриальной мембраны Sls1p. Эти наблюдения привели нас к предположению ранее, что мтРНК-полимераза, Nam1p и Sls1p работают вместе для координации транскрипции и трансляции генных продуктов, кодируемых мтДНК. Здесь мы демонстрируем путем специфического мечения продуктов митохондриальных генов in vivo, что Nam1p и Sls1p действительно работают вместе в пути, который необходим глобально для эффективной митохондриальной трансляции. Точно так же мутации в ATD приводят к аналогичному общему снижению эффективности митохондриальной трансляции и чувствительности к ингибитору митохондриальной трансляции эритромицину. Эти данные в сочетании с наблюдением, что ATD необходим для совместной очистки Sls1p в ассоциации с нуклеоидами мтДНК, позволяют предположить, что эффективная экспрессия кодируемых мтДНК генов у дрожжей включает сложную серию взаимодействий, которые локализуют активные транскрипционные комплексы на внутренней мембране в чтобы согласовать перевод с транскрипцией.

Зайдель-Роголь, Б.Л., МакКаллох, В., Шадель, Г.С. Митохондриальный фактор транскрипции человека B1 метилирует рибосомную РНК в консервативной петле ствола. (2003) Генетика природы. 33(1):23-4. DOI: 10.1038/ng1064

+ развернуть аннотацию

2002

Коэльо, П.С., Брайан, AC, Кумар, А., Шадель, Г.С., Снайдер, М. Новый митохондриальный белок Tar1p кодируется на антисмысловой цепи ядерной 25S рДНК. (2002) Гены и развитие. 16(21):2755-60. DOI: 10.1101/gad.1035002

+ развернуть аннотацию

Широко распространено мнение, что у эукариот гены, кодирующие белки и структурные РНК, не перекрываются. Используя стратегию мечения транспозонов для глобального анализа генома Saccharomyces cerevisiae на предмет экспрессированных генов, мы идентифицировали множественные вставки в открытой рамке считывания, которые полностью содержатся внутри и транскрибируются антисмысловыми по отношению к гену 25S рРНК в ядерной области повторов рДНК на хромосоме XII. Экспрессия этого гена, TAR1 (Transcript Antisense to Ribosomal RNA), может быть обнаружена на уровне РНК и белка, а первичная последовательность соответствующего белка из 124 аминокислот сохраняется у нескольких видов дрожжей. Было обнаружено, что Tar1p локализуется в митохондриях, и избыточная экспрессия белка подавляет фенотип дефицита дыхания petite точечной мутации в митохондриальной РНК-полимеразе, которая влияет на экспрессию митохондриального гена и стабильность мтДНК. Эти находки указывают на то, что кодирующая информация для белков и структурных РНК может перекрываться, поднимая вопросы, касающиеся коэволюции таких сложных генов, а также предполагают, что транскрипция рДНК и функция митохондрий скоординировано регулируются в эукариотических клетках.

О'Рурк, Т.В., Дудикан, Н.А., Маккерет, доктор медицины, Доетч, П.В., Шадель, Г.С. Митохондриальная дисфункция из-за окислительного повреждения митохондриальной ДНК уменьшается за счет совместных действий различных белков. (2002) Молекулярная и клеточная биология. 22 (12): 4086-93.

+ развернуть аннотацию

Митохондриальный геном является значительной мишенью экзогенных и эндогенных генотоксических агентов; однако детерминанты, которые управляют этой восприимчивостью, и пути, доступные для сопротивления повреждению митохондриальной ДНК (мтДНК), недостаточно хорошо охарактеризованы. Здесь мы сообщаем, что окислительное повреждение мтДНК повышено у штаммов, лишенных Ntg1p, предоставляя первое прямое функциональное доказательство того, что этот митохондриально-локализованный фермент эксцизионной репарации оснований функционирует для защиты мтДНК. Однако нулевые по ntg1 штаммы не проявляют митохондриального фенотипа с дефицитом дыхания (petite), что указывает на то, что повреждение мтДНК регулируется совместными действиями множественных путей устойчивости к повреждениям. Нулевые мутации в ABF2 или PIF1, двух генах, участвующих в поддержании и рекомбинации мтДНК, демонстрируют синтетическо-петитный фенотип в сочетании с нулевыми мутациями ntg1, что сопровождается усиленным точечным мутагенезом мтДНК в соответствующих штаммах с двойными мутациями. Этот фенотип был частично восстановлен малоновой кислотой, что указывает на то, что активные формы кислорода, генерируемые электрон-транспортной цепью, способствуют митохондриальной дисфункции у штаммов abf2 Delta. Напротив, когда два других гена, участвующих в рекомбинации мтДНК, CCE1 и NUC1, были инактивированы, сильный синтетический-петитный фенотип не наблюдался, что позволяет предположить, что эффекты, опосредованные Abf2p и Pif1p, обусловлены новой активностью этих белков, отличной от рекомбинации. Эти результаты подтверждают существование независимых от рекомбинации механизмов в дополнение к эксцизионной репарации оснований для борьбы с окислительным повреждением мтДНК у Saccharomyces cerevisiae. Такие системы, вероятно, имеют отношение к тем, которые работают в клетках человека, где рекомбинация мтДНК менее распространена, подтверждая, что дрожжи являются модельной системой для изучения этих важных вопросов.

Зайдель-Роголь Б.Л., Шадель, Г.С. Модуляция митохондриальной транскрипции в ответ на истощение и восполнение мтДНК в клетках HeLa. (2002) Исследования нуклеиновых кислот. 30 (9): 1929-34.

+ развернуть аннотацию

Стационарные количества митохондриальных транскриптов и транскрипционных белков были проанализированы во время истощения мтДНК и последующего восполнения, чтобы получить представление о регуляции экспрессии митохондриальных генов человека. Как было задокументировано ранее, было обнаружено, что клетки HeLa, лишенные мтДНК посредством обработки бромистым этидием (EB), содержат пониженные устойчивые уровни митохондриального фактора транскрипции h-mtTFA. Когда частично истощенные по мтДНК клетки культивировали в отсутствие EB, h-mtTFA восстанавливалась до нормального уровня значительно медленнее, чем мтДНК. Человеческая мтРНК-полимераза демонстрирует сходный профиль истощения-пополнения, что указывает на то, что механизм митохондриальной транскрипции координированно регулируется в ответ на изменения числа копий мтДНК. Вновь синтезированные митохондриальные транскрипты обнаруживались на ранней стадии восстановления, несмотря на то, что мтДНК, вч-мтТФА и вч-мтРНК-полимераза были одновременно истощены. Несмотря на задержку по отношению к мтДНК, количество вч-мтТЖК и вч-мтРНК-полимеразы резко возрастало на поздних стадиях фазы восстановления, что сопровождалось ускорением скорости транскрипции и репликации мтДНК. В целом эти данные указывают на то, что при низком числе копий мтДНК полезно предотвращать накопление митохондриальных транскрипционных белков. Кроме того, h-mtTFA и h-mtRNA полимераза либо в норме присутствуют в количестве, превышающем количество, необходимое для транскрипции, либо их активность повышается, чтобы обеспечить непрерывную экспрессию и зависимую от транскрипции репликацию митохондриального генома в состояниях с истощением мтДНК.

Маккалох В., Зайдель-Роголь Б.Л., Шадель, Г.С. Митохондриальный транскрипционный фактор человека родственен РНК-аденинметилтрансферазам и связывает S-аденозилметионин. (2002) Молекулярная и клеточная биология. 22 (4): 1116-25.

+ развернуть аннотацию

Важным шагом к пониманию митохондриальной генетики и ее влияния на болезни человека является идентификация и характеристика полного набора кодируемых ядром факторов, необходимых для экспрессии митохондриальных генов и репликации митохондриальной ДНК (мтДНК). Двумя факторами, необходимыми для инициации транскрипции с митохондриального промотора человека, являются h-мтРНК-полимераза и ДНК-связывающий фактор транскрипции, h-mtTFA. Однако на основании исследований в модельных системах было постулировано существование второго человеческого митохондриального фактора транскрипции. Здесь мы сообщаем о выделении кДНК, кодирующей h-mtTFB, человеческого гомолога митохондриального фактора транскрипции Saccharomyces cerevisiae B (sc-mtTFB) и первого многоклеточного члена этого класса факторов транскрипции, которому был присвоен ген. Рекомбинантный h-mtTFB способен связывать мтДНК неспецифическим образом и активирует транскрипцию с промотора легкой цепи митохондрий человека в присутствии h-mtTFA in vitro. Примечательно, что h-mtTFB и его грибковые гомологи родственны по первичной последовательности суперсемейству N6 аденин РНК метилтрансфераз. Это наблюдение в сочетании со способностью рекомбинантного h-mtTFB связывать S-аденозилметионин in vitro позволяет предположить, что между этим классом факторов транскрипции и этим семейством ферментов модификации РНК существует структурная и, возможно, функциональная связь, и что h-mtTFB может выполняют двойные функции во время экспрессии митохондриальных генов.

Брайан, AC, Родехеффер, MS, Уирн, CM, Шадель, Г.С. Sls1p является мембраносвязанным регулятором связанных с транскрипцией процессов, участвующих в экспрессии митохондриального гена Saccharomyces cerevisiae. (2002) Генетика. 160 (1): 75-82.

+ развернуть аннотацию

Митохондриальная трансляция в значительной степени связана с мембраной у S. cerevisiae. Недавно мы обнаружили, что матричный белок Nam1p связывается с амино-концевым доменом дрожжевой мтРНК-полимеразы, чтобы связать события трансляции и/или процессинга РНК с транскрипцией. Чтобы получить дополнительное представление об этих процессах, связанных с транскрипцией, мы провели генетический скрининг генов, которые подавляют миниатюрный фенотип точечной мутации в мтРНК-полимеразе (rpo41-R129D) при сверхэкспрессии. Одним из супрессоров, идентифицированных в этом скрининге, был SLS1, который кодирует белок митохондриальной мембраны, необходимый для сборки ферментных комплексов дыхательной цепи III и IV. Дефекты процессинга мтРНК, связанные с мутацией rpo41-R129D, были исправлены в подавленном штамме, связывая Sls1p с путем, который включает мтРНК-полимеразу и Nam1p. Это было подтверждено наблюдением, что сверхэкспрессия SLS1 восстанавливала миниатюрный фенотип нулевой мутации NAM1. Напротив, сверхэкспрессия Nam1p не восстанавливала миниатюрный фенотип нулевой мутации SLS1, указывая на то, что Nam1p и Sls1p не являются функционально перекрывающимися, а скорее существуют в упорядоченном пути. На основании этих данных предложена модель, в которой Nam1p координирует доставку вновь синтезированных транскриптов к мембране, где Sls1p направляет или регулирует их последующую обработку мембраносвязанными факторами, участвующими в трансляции.

2001

Шадель, Г.С., Зайдель-Роголь, БЛ Диагностические анализы дефектов репликации и транскрипции мтДНК у дрожжей и человека. (2001) Методы клеточной биологии. 80:465-79. DOI: 10.1016/S0091-679X(06)80023-3

Зайдель-Роголь Б.Л., Шадель, Г.С. Диагностические анализы дефектов репликации и транскрипции митохондриальной ДНК в клетках дрожжей и человека. (2001) Методы клеточной биологии. 65:413-27. DOI: 10.1016/s0091-679x(01)65024-6

Родехеффер, М.С., Бун, Б.Э., Брайан, AC, Шадель, Г.С. Nam1p, белок, участвующий в процессинге и трансляции РНК, связан с транскрипцией посредством взаимодействия с дрожжевой митохондриальной РНК-полимеразой. (2001) Журнал биологической химии. 276(11):8616-22. DOI: 10.1074/jbc.M009901200

+ развернуть аннотацию

Выравнивание трех грибковых мтРНК-полимераз выявило консервативные аминокислотные последовательности в амино-концевой области фермента Saccharomyces cerevisiae, которые ранее предполагались как содержащие важный функциональный домен. Фенотипический анализ делеций и точечных мутаций в сочетании с двухгибридным анализом дрожжей показал, что Nam1p, белок, участвующий в процессинге и трансляции РНК в митохондриях, специфически связывается с этим доменом. Значение этого взаимодействия in vivo было продемонстрировано тем фактом, что чувствительный к температуре фенотип делеционной мутации (rpo41Delta2), который затрагивает этот амино-концевой домен, подавляется сверхпродукцией Nam1p. Кроме того, мутации в амино-концевом домене приводят к снижению стационарных уровней зрелых митохондриальных транскриптов CYTB и COXI, что является первичным дефектом, наблюдаемым у штаммов дрожжей с нулевой мутацией NAM1. Наконец, одна точечная мутация (R129D) не отменяла связывание Nam1p, но демонстрировала очевидный дефект транскрипта COX1/CYTB. Эта мутация проявляет наиболее тяжелый митохондриальный фенотип, указывая на то, что мутации в амино-концевом домене могут нарушать другие критические взаимодействия, помимо связывания Nam1p, которые вносят вклад в наблюдаемые фенотипы. Эти результаты указывают на то, что амино-концевой домен мтРНК-полимераз связывает дополнительные факторы и активности, участвующие в экспрессии митохондриальных генов, непосредственно с механизмом транскрипции.

2000

Дивайн, Дж. Х., Шадель, Г.С. Анализ аутоиндукторной активности с помощью люминесцентных сенсорных штаммов Escherichia coli, содержащих модифицированный регулон Vibrio fischeri lux. (2000) Мет. фермент. 305:279-87. DOI: 10.1016/s0076-6879(00)05494-x

Шадель, Г.С., Бакенмейер, Г.А., Клейтон, Д.А., Шмитт, М.Э. Мутационный анализ РНК-компонента Saccharomyces cerevisiae РНКазы MRP выявляет различные ядерные фенотипы. (2000) Ген. 245(1):175-84. DOI: 10.1016/s0378-1119(00)00013-5

+ развернуть аннотацию

340-нуклеотидный РНК-компонент РНКазы Saccharomyces cerevisiae MRP кодируется единственной копией основного гена NME1. Чтобы получить дополнительное представление о предполагаемой структуре и функциях этой эндорибонуклеазы, мы подвергли обширному мутагенезу ген NME1 и охарактеризовали штаммы дрожжей, экспрессирующие мутированные формы РНК, используя метод перетасовки генов. Штаммы, экспрессирующие каждую из 26 независимых мутаций в гене РНКазы MRP, были охарактеризованы по их способности расти при различных температурах и на различных источниках углерода, стабильности РНКазы MRP РНКазы и процессингу 5.8S рРНК (ядерная функция РНКазы MRP) . 11 мутаций привели к летальному фенотипу, шесть продемонстрировали летальность в зависимости от температуры, а несколько предпочли неферментируемый источник углерода для роста. У тех мутантов, которые демонстрировали измененные фенотипы роста, серьезность дефекта роста была прямо пропорциональна серьезности дефекта процессинга 5.8S рРНК в ядре. Вместе этот анализ определил основные области РНК РНКазы MRP и предоставил доказательства, которые согласуются с предполагаемой функцией фермента РНКазы MRP.

1999

Шадель, Г.С. Дрожжи как модель репликации мтДНК человека. (1999) Американский журнал генетики человека. 65(5):1230-7. DOI: 10.1086/302630

Ван, Ю., Шадель, Г.С. Для стабильности митохондриального генома необходим амино-концевой домен митохондриальной РНК-полимеразы дрожжей. (1999) Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 96(14):8046-51. DOI: 10.1073/pnas.96.14.8046

+ развернуть аннотацию

Митохондриальные РНК (мтРНК) полимеразы родственны РНК-полимеразам бактериофагов, но содержат уникальное амино-концевое удлинение неизвестного происхождения и функции. В дополнение к информации о нацеливании на митохондрии мы показываем здесь, что амино-концевое удлинение дрожжевой мтРНК-полимеразы необходимо для функции поддержания мтДНК, которая отделена от известной активности фермента по полимеризации РНК. Делеция 185 N-концевых аминокислот фермента приводит к чувствительному к температуре митохондриальному миниатюрному фенотипу, характеризующемуся повышенной нестабильностью и возможной потерей митохондриального генома. Эта мутация в значительной степени не влияет на инициацию митохондриальной транскрипции in vivo, и экспрессия только амино-концевой части белка в транс-положении частично подавляет митохондриальный дефект, указывая на то, что амино-концевое расширение фермента содержит независимый функциональный домен, необходимый для репликация и/или стабильность мтДНК. Эти результаты позволяют предположить, что амино-концевые удлинения, присутствующие в мтРНК-полимеразах, содержат функциональные домены, которые связывают дополнительную активность с процессом транскрипции в митохондриях.

1997

Шадель, Г.С., Клейтон, Д.А. Поддержание митохондриальной ДНК у позвоночных. (1997) Ежегодный обзор биохимии. 66:409-35. DOI: 10.1146/annurev.biochem.66.1.409

+ развернуть аннотацию

Открытие того, что мутации в митохондриальной ДНК (мтДНК) могут быть патогенными для человека, повысило интерес к пониманию поддержания мтДНК. Функциональное состояние мтДНК требует большого количества факторов для экспрессии генов, репликации ДНК и репарации ДНК. Эти процессы в конечном итоге контролируются ядром клетки, поскольку все необходимые белки кодируются ядерными генами и импортируются в митохондрии. Репликация и транскрипция ДНК связаны в митохондриях позвоночных, потому что транскрипты РНК, инициированные на промоторе легкой цепи, являются праймерами для репликации мтДНК в начале тяжелой цепи. Изучение этого механизма репликации ДНК с примированием транскрипции привело к выделению ключевых факторов, участвующих в репликации и транскрипции мтДНК, а также к выяснению уникальных структур нуклеиновых кислот, образующихся в этом источнике. Т.к. признаки транскрипционно-праймированного механизма, по-видимому, законсервированы у позвоночных, предложена общая модель инициации синтеза тяжелой нити ДНК у позвоночных. У многих организмов поддержание мтДНК требует не только верной репликации мтДНК, но также репарации и рекомбинации мтДНК. Оценивается также степень, в которой эти последние два процесса участвуют в поддержании мтДНК у позвоночных.

1996

Ситников Д.М., Шадель, Г.С., Болдуин, ТО Независимые от аутоиндуктора мутанты активатора транскрипции LuxR проявляют различные эффекты на два промотора lux Vibrio fischeri. (1996) Молекулярная и общая генетика. 252(5):622-5. DOI: 10.1007/bf02172408

+ развернуть аннотацию

Белок LuxR представляет собой активатор транскрипции, который вместе с диффундирующей малой молекулой, называемой аутоиндуктором [N-(3-оксогексаноил)-L-гомосеринлактон], представляет собой первичный уровень регуляции генов биолюминесценции у Vibrio fischeri. LuxR в присутствии аутоиндуктора активирует транскрипцию кластера генов luxICDABEG и как положительно, так и отрицательно ауторегулирует транскрипцию дивергентно ориентированного гена luxR, активируя транскрипцию при низких уровнях аутоиндуктора и подавляя синтез при высокой концентрации аутоиндуктора. Были охарактеризованы семь точечных мутантов LuxR, которые активируют транскрипцию V. fischeri lux в отсутствие аутоиндуктора (LuxR*). Белки LuxR* активировали транскрипцию генов биолюминесценции до уровней, в 1.5-40 раз превышающих уровни, достигаемые LuxR дикого типа без аутоиндуктора. Все мутанты LuxR* сохраняли чувствительность к аутоиндуктору. Однако в каждом случае степень стимуляции в ответ на аутоиндуктор была ниже, чем у LuxR дикого типа. Белки LuxR* сохранили потребность в аутоиндукторе для ауторегуляции гена luxR. Мы предполагаем, что белок LuxR существует в двух конформациях: в неактивной форме и в активной форме, которая преобладает в присутствии аутоиндуктора. Мутации LuxR*, по-видимому, сдвигают равновесное распределение этих двух форм, чтобы увеличить количество активной формы в отсутствие аутоиндуктора, в то время как аутоиндуктор все еще может преобразовывать неактивные виды в активные. Различные эффекты белков LuxR* на двух lux-промоторах позволяют предположить, что LuxR стимулирует транскрипцию PluxR по механизму, отличному от механизма, используемого на промоторе PluxI, подразумевая, что связывание LuxR с его сайтом связывания, которое, как известно, необходимо для активации транскрипции, может не быть достаточным.

Шадель, Г.С., Клейтон, Д.А. Выделение и характеристика гомологов митохондриального фактора транскрипции А позвоночных. (1996) Мет. фермент. 264:149-58. DOI: 10.1016/s0076-6879(96)64016-6

Шадель, Г.С., Клейтон, Д.А. Картирование промоторов в области петли смещения митохондриальной ДНК позвоночных. (1996) Мет. фермент. 264:139-48. DOI: 10.1016/s0076-6879(96)64015-4

Карродегуас, Дж. А., Юн, С., Шадель, Г.С., Клейтон, Д.А., Богенхаген, Д.Ф. Функциональная консервация mtTFB дрожжей, несмотря на значительное расхождение последовательностей. (1996) Джин Экспр. 6 (4): 219-30.

+ развернуть аннотацию

Транскрипция мтДНК у дрожжей S. cerevisiae зависит от распознавания консенсусной ненуклеотидной промоторной последовательности мтРНК-полимеразой, действующей с диссоциирующим фактором молекулярной массой 40 кДа, известным как mtTFB или Mtflp. mtTFB был клонирован и охарактеризован у S. cerevisiae, но не изучался столь подробно ни в одном другом организме. Хотя известно, что митохондриальная транскрипция у молочных дрожжей Kluyveromyces lactis инициируется в рамках той же согласованной последовательности промотора, что и у S. cerevisiae, никакие предыдущие исследования не были сосредоточены на белках, участвующих в инициации транскрипции у K. lactis. В этой статье мы сообщаем о клонировании mtTFB из K. lactis и из дрожжей, более близких к S. cerevisiae, S. kluyveri. Оба новых гена mtTFB оказались способны заменить ген MTF1 у S. cerevisiae. Оба белка, очищенные после экспрессии в E. coli, были способны поддерживать специфическую инициацию транскрипции in vitro с помощью мтРНК-полимеразы S. cerevisiae. Белки mtTFB S. kluyveri и K. lactis имеют только 56% и 40% идентичности с mtTFB S. cerevisiae соответственно. Выравнивание трех последовательностей mtTFB не выявило каких-либо областей размером более 30 аминокислот с аминокислотной идентичностью более 60%. В частности, области, предположительно демонстрирующие сходство последовательностей с бактериальными сигма-факторами, не были более консервативны, чем другие области белков mtTFB. Во всех трех генах mtTFB дрожжей отсутствуют обычные амино-концевые митохондриальные направляющие последовательности, что указывает на то, что все три белка могут быть импортированы в митохондрии с помощью того же необычного механизма, который описан для mtTFB S. cerevisiae.

1995

Дайраги, диджей, Шадель, Г.С., Клейтон, Д.А. Для инициации транскрипции необходимы человеческий митохондриальный транскрипционный фактор А и целостность промоторных промежутков. (1995) Биохимика и биофизика Acta. 1271(1):127-34. DOI: 10.1016/0925-4439(95)00019-z

+ развернуть аннотацию

Два основных промотора транскрипции митохондриального генома человека расположены рядом друг с другом в области петли смещения молекулы. Предыдущая работа локализовала эти промоторы в областях <100 нуклеотидов каждая; строго требуется последовательность ДНК в месте начала транскрипции, а также в области от -10 до -40 пар оснований перед каждым соответствующим сайтом начала. Каждый восходящий сайт распознается и связывается с человеческим митохондриальным фактором транскрипции A (h-mtTFA), событие, ранее показанное как важное для активации транскрипции. Мы сообщаем здесь результаты с использованием рекомбинантной h-mtTFA, которые демонстрируют зависимость инициации транскрипции h-mtTFA. Кроме того, изменение расстояния между сайтом связывания h-mtTFA и сайтом начала транскрипции значительно снижает эффективность инициации транскрипции. Было показано, что снижение эффективности инициации транскрипции является следствием изменения положения связывания h-mtTFA, в отличие от силы связывания h-mtTFA, судя по способности ДНК-футпринтинга. Анализ химерного промотора дрожжей-человек показал, что дрожжевой гомолог mtTFA не может заменить белок человека, даже если он связан в подходящем положении перед сайтом начала транскрипции человека.

Дайраги, диджей, Шадель, Г.С., Клейтон, Д.А. Добавление карбоксиконцевого хвоста из 29 остатков превращает простой белок, содержащий блок HMG, в активатор транскрипции. (1995) Журнал молекулярной биологии. 249(1):11-28. DOI: 10.1006/jmbi.1995.9889

+ развернуть аннотацию

Митохондриальный фактор транскрипции человека А (h-mtTFA) необходим для инициации транскрипции с двух промоторов, расположенных в области петли смещения митохондриальной ДНК человека. Этот белок массой 25 кДа содержит два тандемных ДНК-связывающих домена HMG box, разделенных линкерной областью из 27 аминокислотных остатков, за которой следует карбоксильный концевой хвост из 25 остатков; и линкер, и хвост богаты основными аминокислотными остатками. Мутационный анализ h-mtTFA показал, что хвостовая область важна для специфического распознавания ДНК и необходима для активации транскрипции. Критическая роль человеческого хвоста в транскрипции была подтверждена путем конструирования химерных белков, которые обменивались сходными областями между h-mtTFA и его гомологом Saccharomyces cerevisiae, sc-mtTFA. sc-mtTFA дикого типа неспособна активировать транскрипцию с промотора легкой цепи митохондрий человека (LSP). Добавление области человеческого хвоста к sc-mtTFA приводило к активации LSP-специфического промотора. Во всех различных протестированных мутациях h-mtTFA активация транскрипции коррелировала со специфической ДНК-связывающей активностью, предполагая, что эти две функции могут быть неразделимы, что полностью согласуется с предыдущим мутационным анализом митохондриальных промоторов человека.

Шадель, Г.С., Клейтон, Д.А. Митохондриальный транскрипционный фактор Saccharomyces cerevisiae, sc-mtTFB, имеет общие черты с сигма-факторами, но функционально отличается. (1995) Молекулярная и клеточная биология. 15(4):2101-8. DOI: 10.1128/mcb.15.4.2101

+ развернуть аннотацию

В митохондриях Saccharomyces cerevisiae sc-mtTFB представляет собой транскрипционный фактор из 341 аминокислоты, необходимый для инициации транскрипции с промоторов митохондриальной ДНК. Специфическая транскрипция in vitro требует только sc-mtTFB и коровой sc-mtRNA полимеразы, родственной бактериофагу. Мутационный анализ sc-mtTFB определил две области белка, которые важны для нормального функционирования как in vivo, так и in vitro. Эти области перекрывают части белка, которые проявляют сходство с консервативной областью 2 бактериальных сигма-факторов. Одна мутация в этой области sc-mtTFB (от тирозина 108 до аргинина [Y108R]) имеет дефектный фенотип, который соответствует наблюдаемому для мутаций в соответствующем остатке белков сигма-А и сигма-Е Bacillus subtilis. Однако мутации в sigma 2.4-подобной области, включая 5-аминокислотную делецию, соответствующую ключевым аминокислотам, контактирующим с промотором сигма-факторов, не устраняли способность sc-mtTFB инициировать транскрипцию специфически in vitro. Это указывает на механизм распознавания промотора для sc-мтРНК-полимеразы, отличный от механизма, используемого бактериальными РНК-полимеразами. Две мутации в основной области sc-mtTFB приводили к дефектным белкам, которые фактически зависели от сверхскрученных матриц ДНК in vitro. Эти мутации, возможно, нарушили функцию sc-mtTFB по раскручиванию ДНК, которая проявляется только in vitro и частично восстанавливается за счет суперспирализации ДНК.

1993

Шадель, Г.С., Клейтон, Д.А. Инициация митохондриальной транскрипции. Вариация и консервация. (1993) Журнал биологической химии. 268 (22): 16083-6.

1992

Шадель, Г.С., Болдуин, ТО Положительная ауторегуляция гена luxR Vibrio fischeri. LuxR и аутоиндуктор активируют транскрипцию белка-активатора гена цАМФ-катаболита независимо от комплекса и -зависимую транскрипцию luxR. (1992) Журнал биологической химии. 267 (11): 7696-702.

+ развернуть аннотацию

Белок LuxR представляет собой активатор транскрипции, участвующий в регуляции генов, необходимых для биолюминесценции (lux) у морской бактерии Vibrio fischeri. Транскрипция двух дивергентно ориентированных lux-оперонов (luxR и luxICDABEG) активируется LuxR в присутствии диффундирующего индуктора (аутоиндуктора). Транскрипция гена luxR подвергается как положительной, так и отрицательной ауторегуляции, а также активации белковым комплексом цАМФ-катаболитного гена-активатора (цАМФ-САР). Транскрипцию luxR изучали с использованием как люминесценции in vivo в качестве репортера, так и анализа удлинения праймера мРНК, синтезированной in vivo. Мутация сайта связывания lux CAP приводила к уменьшению люминесценции репортера и полной потере luxR-позитивной ауторегуляции. Положительная ауторегуляция восстанавливалась, если luxR был предоставлен в транс, демонстрируя, что LuxR и аутоиндуктор активируют транскрипцию luxR в отсутствие цАМФ-САР. С помощью анализа удлинения праймера были продемонстрированы три сайта инициации транскрипции luxR; инициация в двух из этих сайтов требовала цАМФ-САР. Количество всех трех транскриптов увеличивалось в присутствии LuxR и аутоиндуктора при использовании плазмиды с сайтом связывания CAP дикого типа. Инициация в цАМФ-САР-зависимых сайтах не наблюдалась для плазмиды с мутировавшим САР-связывающим сайтом в присутствии или в отсутствие аутоиндуктора даже с luxR, поставляемым в транс. Вместо этого, при подаче luxR в транс, инициация в независимом от цАМФ-САР сайте инициации специфически стимулировалась LuxR и аутоиндуктором. Таким образом, в ходе позитивной ауторегуляции белок LuxR активирует транскрипцию с двух промоторов luxR по цАМФ-САР-зависимому механизму и с третьего промотора по цАМФ-САР-независимому механизму.

Шадель, Г.С., Болдуин, ТО Идентификация удаленно расположенного регуляторного элемента в гене luxD, необходимого для негативной ауторегуляции гена luxR Vibrio fischeri. (1992) Журнал биологической химии. 267 (11): 7690-5.

+ развернуть аннотацию

Экспрессия биолюминесценции у морской бактерии Vibrio fischeri контролируется уникальным регулирующим механизмом, зависящим от плотности клеток, называемым аутоиндукцией. Гены, необходимые для биолюминесценции (гены lux), организованы в два дивергентно транскрибируемых оперона (luxR-luxICDABEG). Один оперон (luxICDABEG) содержит гены, необходимые для производства света (luxCDABE) и синтеза диффундирующей сигнальной молекулы, называемой аутоиндуктором (luxI). Другой оперон содержит ген luxR, кодирующий регуляторный белок транскрипции, который активирует транскрипцию обоих оперонов lux в присутствии аутоиндуктора. Этот двунаправленный стимулирующий механизм приводит к цепи положительной обратной связи, которая приводит к быстрому увеличению производства света при определенной плотности культуральных клеток, что характерно для аутоиндукции. Транскрипционная положительная обратная связь, по-видимому, ограничена отрицательной ауторегуляторной схемой, через которую LuxR ингибирует собственный синтез. Для транскрипционно-негативной ауторегуляции требуется аутоиндуктор, lux-оператор, расположенный в контрольной области (которая является сайтом связывания LuxR), и отрицательно действующие последовательности ДНК в опероне luxICDABEG. Делеционный анализ оперона luxICDABEG показал, что отрицательно действующий элемент расположен в гене luxD в положении 2.0 килобаз от оператора lux. Нуклеотидная последовательность этого элемента luxD аналогична оператору lux (11 из 20 пар оснований идентичны) и может функционировать как сайт связывания LuxR, когда он заменяет оператор lux в контрольной области. Эти результаты предполагают, что элемент luxD функционирует как сайт связывания с низким сродством для LuxR и что занятие этого сайта необходимо для достижения транскрипционно-негативной ауторегуляции luxR.

1991

Шадель, Г.С., Болдуин, ТО Белок Vibrio fischeri LuxR способен к двунаправленной стимуляции транскрипции и как положительной, так и отрицательной регуляции гена luxR. (1991) Дж. Бактериол. 173(2):568-74. DOI: 10.1128/jb.173.2.568-574.1991

+ развернуть аннотацию

Регуляция генов, необходимых для биолюминесценции, у морской бактерии Vibrio fischeri (lux regulon) представляет собой сложный процесс, требующий координации нескольких систем. Первичный уровень регуляции опосредуется положительным регуляторным белком LuxR и небольшой диффундирующей молекулой, N-(3-оксо-гексаноил)-гомосеринлактоном, называемым аутоиндуктором. Транскрипция гена luxR, кодирующего регуляторный белок, позитивно регулируется циклической системой AMP-CAP. Люкс-регулон V. fischeri состоит из двух дивергентно транскрибируемых оперонов, обозначенных как оперон L и оперон R. Транскрипция правого оперона (operonR; luxICDABE), состоящего из генов, необходимых для синтеза аутоиндуктора (luxI) и продукции света (luxCDABE), активируется LuxR зависимым от аутоиндуктора образом. Левый оперон (operonL) состоит из одного известного гена luxR. Также было показано, что белок LuxR снижает транскрипцию оперона L посредством аутоиндуктор-зависимого механизма, тем самым отрицательно регулируя свой собственный синтез. В этой статье мы демонстрируем, что зависимая от аутоиндуктора репрессия транскрипции оперона L требует не только LuxR, но и последовательностей ДНК внутри оперона R, которые расположены выше промотора для оперона L. В отсутствие этих последовательностей ДНК белок LuxR вызывает аутоиндуктор-зависимую активацию транскрипции оперона L. Оператор lux, расположенный в контрольной области между двумя оперонами, требовался как для положительного, так и для отрицательного ответа, зависящего от аутоиндуктора. Путем титрования высоких уровней LuxR, поставляемых in trans с синтетическим аутоиндуктором, мы обнаружили, что низкие уровни аутоиндуктора могут вызывать положительный ответ даже в присутствии отрицательно действующих последовательностей ДНК, в то время как более высокие уровни аутоиндуктора приводили к отрицательному ответу. Без этих последовательностей ДНК в опероне R LuxR и аутоиндуктор стимулировали транскрипцию независимо от уровня аутоиндуктора. Эти результаты позволяют предположить, что переключение между стимуляцией и репрессией транскрипции оперона L опосредовано уровнями комплекса LuxR-аутоиндуктор, который в этих экспериментах отражает уровень аутоиндуктора в питательной среде.

1990

Шадель, Г.С., Янг Р., Болдуин Т.О. Использование регулируемого лизиса клеток в летальной генетической селекции Escherichia coli: идентификация области связывания аутоиндуктора белка LuxR из Vibrio fischeri ATCC 7744. (1990) Дж. Бактериол. 172(7):3980-7. DOI: 10.1128/jb.172.7.3980-3987.1990

+ развернуть аннотацию

Летальная генетическая селекция с использованием генов лизиса лямбда бактериофага (S, R, RZ) была разработана и использована в сочетании с люминесцентным скринингом, чтобы позволить выделить и охарактеризовать шесть миссенс-мутаций и две нонсенс-мутации в гене luxR из Vibrio fischeri ATCC. 7744–79. Транскрипционное слияние генов лизиса в опероне R, расположенном ниже укороченного гена luxI, позволяет контролировать лизис клеток путем добавления синтетического аутоиндуктора в питательную среду. Шесть выделенных миссенс-мутаций привели к замене белка LuxR Asp в положении 79 на Asn (далее обозначенный как D82N), V109I, V118L, L123F, S217I и H79Y. Было показано, что варианты белков LuxR с аминокислотными изменениями D82N, V82I, V127L и H49Y требуют более высоких концентраций аутоиндуктора для получения определенной амплитуды ответа, чем это требуется белку дикого типа. Мы считаем, что кластеризация в общей сложности семи случайно сгенерированных миссенс-мутаций в 79-аминокислотной области первичной последовательности LuxR определяет критическую часть белка LuxR. Наблюдение, что белки с повреждениями в этой области реагируют на повышенные уровни аутоиндуктора, позволяет предположить, что сайт связывания аутоиндуктора построен, по крайней мере частично, из нескольких аминокислотных остатков в районе 127-XNUMX белка LuxR.

Шадель, Г.С., Дивайн, Дж. Х., Болдуин, ТО Контроль люксового регулона Vibrio fischeri. (1990) Дж. Биолюмин. Хемилюмин. 5(2):99-106. DOI: 10.1002/био.1170050205

+ развернуть аннотацию

Регуляция экспрессии биолюминесценции Vibrio fischeri lux regulon в Escherichia coli является следствием уникальной формы положительной обратной связи, наложенной на плохо определенный цис-действующий механизм репрессии. Люкс регулон состоит из двух оперонов, транскрибируемых по-разному. Левый оперон содержит только один ген luxR, который кодирует белок-активатор транскрипции. Правый оперон содержит luxI, который вместе с luxR и 218 парами оснований, разделяющих два оперона, составляет первичную регуляторную цепь и пять структурных генов, luxC, luxD, luxA, luxB и luxE, которые необходимы для биолюминесцентной активности. Транскрипцию luxR из PL стимулируют связыванием продукта гена crp E. coli с последовательностью TGTGACAAAAATCCAA выше предполагаемого промотора. Связывание чистого белка CAP E. coli в цАМФ-зависимой реакции с регуляторной областью V. fischeri lux было продемонстрировано с помощью футпринтинга in vitro. Продукт гена luxI представляет собой фермент, который катализирует реакцию конденсации цитоплазматических субстратов с образованием аутоиндуктора, N-(3-оксогексаноил)гомосеринлактона. Накопление свободно диффундирующего аутоиндуктора приводит к образованию комплекса с LuxR. Комплекс связывается с последовательностью ACCTGTAGGATCGTACAGGT перед PR, чтобы стимулировать транскрипцию правого оперона. Повышенная транскрипция от PR должна давать повышенные уровни LuxI и более высокие уровни аутоиндуктора, которые дополнительно активируют LuxR. Сайт связывания LuxR также является сайтом связывания LexA, о чем свидетельствует футпринтинг in vitro. Базальная транскрипция как из PL, так и из PR репрессируется последовательностями в кодирующей области luxR.

1989

Дивайн, Дж. Х., Шадель, Г.С., Болдуин, ТО Идентификация оператора люксового регулона из штамма Vibrio fischeri ATCC7744. (1989) Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 86(15):5688-92. DOI: 10.1073/pnas.86.15.5688

+ развернуть аннотацию

Escherichia coli, несущие рекомбинантную плазмиду, несущую регулон Vibrio fischeri lux, проявляют люминесценцию, имитирующую люминесценцию V. fischeri. lux регулон состоит из двух дивергентно транскрибируемых оперонов: правого оперона (гены luxICDABE) и левого оперона (ген luxR). Гены luxR и luxI и контрольная область, разделяющая два оперона, обеспечивают первичный регуляторный контроль над lux-регулоном; Регуляторные механизмы приводят к резкому увеличению скорости синтеза люциферазы после индукции, по-видимому, благодаря уникальному ауторегуляторному механизму положительной обратной связи, и к огромной разнице (более 10(4) в уровнях люминесценции в клетках до и после индукции. Общепринятая модель первичной регуляции биолюминесценции у V. fischeri предполагает взаимодействие продукта гена luxR и N-(3-оксогексаноил)гомосеринлактона, аутоиндуктора, продуцируемого ферментом, кодируемым luxI, первым геном правой оперона с последовательностью оператора в контрольной области для стимуляции транскрипции правого оперона в петле положительной обратной связи. Мы использовали делеционное картирование репортерного вектора транскрипции, чтобы определить приблизительное местоположение оператора. Путем направленного мутагенеза предполагаемого мы продемонстрировали, что инвертированный повтор из 20 пар оснований ACCTGTAGGA/TCGTA CAGGT (где вертикальная линия представляет собой центр симметрии), имеющий поразительное сходство с последовательностью распознавания плейотропного репрессорного белка LexA, является оператором люкс регулон. Мы также обнаружили, что удаление последовательностей перед палиндромом приводит к усилению транскрипции с правого промотора (PR), что свидетельствует о цис-действующем элементе, который репрессирует транскрипцию в отсутствие комплекса LuxR-аутоиндуктор. Модификации палиндрома, которые устраняют стимуляцию LuxR-аутоиндуктором транскрипции из PR, не влияют на репрессию с помощью цис-действующего механизма (механизмов), что позволяет предположить, что палиндром не является необходимым для репрессии правого оперона. Таким образом, оказывается, что значительное увеличение транскрипции при индукции lux-регулона является результатом по крайней мере двух независимых механизмов, одного положительного и другого отрицательного.

Болдуин, Т.О., Дивайн, Дж. Х., Хекель, Р. С., Лин, Дж. В., Шадель, Г.С. Полная нуклеотидная последовательность регулона lux Vibrio fischeri и области luxABN Photobacterium leiognathi и механизм контроля бактериальной биолюминесценции. (1989) Дж. Биолюмин. Хемилюмин. 4(1):326-41. DOI: 10.1002/био.1170040145

+ развернуть аннотацию

Мы определили полную нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК из 7622 пар оснований из штамма Vibrio fischeri ATCC7744, который содержит всю информацию, необходимую для придания плазмидной регулируемой биолюминесценции штаммам Escherichia coli. lux-регулон из V. fischeri состоит из двух дивергентно транскрибируемых оперонов, L (слева) и R (справа), и по крайней мере семи генов, luxR (L-оперон) и luxICDABE (R-оперон) и промежуточной контрольной области. Гены luxA и luxB кодируют соответственно альфа- и бета-субъединицы люциферазы. Порядок генов luxCDABE у V. fischeri такой же, как у V. harveyi. Мы определили последовательность luxAB и фланкирующих областей у Photobacterium leiognathi и обнаружили вышестоящие последовательности, гомологичные luxC у видов Vibrio, но между luxB и luxE находится открытая рамка считывания, кодирующая белок из 227 аминокислот (молекулярная масса 26,229 20). ), который не встречается в этом месте у видов Vibrio. Аминоконцевая аминокислотная последовательность кодируемого белка почти идентична последовательности, определенной О'Кейном и Ли (Университет Джорджии) для нефлуоресцентного флавопротеина из близкородственных видов Photobacterium (д-р Деннис О'Кейн, личное сообщение). Поэтому мы обозначили этот ген luxN. Существует инвертированный повтор ACCTGTAGGAxTCGTACAGGT из 927 оснований, расположенный между основаниями 928 и XNUMX в области между двумя оперонами V. fischeri. Эта область, по-видимому, выполняет две функции: она важна для проявления эффекта белка LuxR и является консенсусным сайтом связывания белка LexA E. coli, отрицательного регуляторного белка, связанного с SOS-ответом. В кодирующей области luxR есть последовательности, которые, по-видимому, функционируют цис-действующим образом, репрессируя транскрипцию как с левых, так и с правых промоторов в отсутствие соответствующих белков-активаторов транскрипции, что приводит к низким базальным уровням транскрипции. Теперь становится ясно, что в системе люкс есть несколько уровней управления, позволяющих модулировать интенсивность биолюминесценции более чем на четыре порядка.

Джеральд Шадель, доктор философии

Институт биологических исследований Солка - Публикации

все публикации

2025

2024

2023

2022

2021

2020

2019

2018

2017

2016

2015

2014

2013

2012

2011

2010

2009

2008

2007

2006

2005

2004

2003

2002

2001

2000

1999

1997

1996

1995

1993

1992

1991

1990

1989

Поддержите исследования Солка

Образование

Награды и награды

Профиль

Особенности

Вебсайт

Контакты